腸内細菌叢の関連解析

Scientific Reports volume 13、記事番号: 9225 (2023) この記事を引用

メトリクスの詳細

視床下部-下垂体-副腎（HPA）軸と視床下部-下垂体-甲状腺（HPT）軸の過剰活性化が急性高地攻撃で発見されたが、腸内微生物叢と代謝物の役割は不明である。我々は、成体雄の Sprague-Dawley ラットを、低圧低酸素室の模擬高度 5500 m で 3 日間利用しました。次いで、ELISA、血清および16S rRNAのメタボローム分析、および糞便サンプルのメタボローム分析を実施した。正常酸素群と比較して、低酸素群では血清副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン (CRH)、副腎皮質刺激ホルモン (ACTH)、コルチコステロン (CORT)、およびチロキシン (tT4) が増加しましたが、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン (TRH) は減少しました。低酸素グループではバクテロイデス、ラクトバチルス、パラバクテロイデス、ブチリシモナス、SMB53、アッカーマンシア、ファスコラルクトバクテリウム、およびエアロコッカスが豊富でしたが、正常酸素グループでは[プレボテラ]、プレボテラ、カイストバクター、サリニバクテリウム、およびヴォゲセラが豊富でした。メタボロミクス分析により、急性低酸素症が糞便および血清の脂質代謝に重大な影響を与えることが示されました。さらに、5 つの糞便代謝物が [プレボテラ]、カイストバクター、パラバクテロイデス、エアロコッカスとの TRH、tT4、および CORT 間のクロストークを媒介する可能性があり、6 つの血清代謝物が [プレボテラ] および tT4 に対する TRH および tT4 の影響を媒介する可能性があることを発見しました。因果媒介分析によるカイストバクター。結論として、この研究は、急性低圧低酸素負荷下で重要な代謝産物が腸内細菌叢とHPA軸およびHPT軸の間のクロストークを媒介するという新たな証拠を提供する。

平地の人が標高 2500 メートル以上の高地に急登すると、通常、急性高山病 (AMS) を経験します。AMS は、不眠症、疲労、めまい、食欲不振、嘔吐を伴う吐き気などのいくつかの症状の組み合わせで発生します1。胃腸の問題2は、高地にさらされた集団の腸内微生物叢に影響を与える可能性があります。プレボテラは高地（3600 m）のチベット人の糞便中に濃縮されているのに対し、バクテロイデスはハンの糞便中に濃縮されていることが判明しました3。標高 4,800 メートルに住むチベット人は、酪酸生成細菌が豊富な植物相を持っています3。 5,000 mを超える高地にさらされた遠征隊員は、糞便中のビフィズス菌などの腸内プロバイオティクスが大幅に減少し、腸内病原性細菌が大幅に増加しました4。

神経内分泌の活動亢進は、免疫機能、血管ストレス、エネルギー代謝、感情、睡眠の調節に関与している可能性があります5,6。いくつかの研究では、ノルエピネフリンとコルチゾールの増加7,8、甲状腺刺激ホルモン（TSH）、チロキシン（tT4）、遊離チロキシン（fT4）、トリヨードチロニン（tT3）の急激な増加など、高地でのさまざまなホルモン濃度の変化が実証されています。遊離トリヨードチロニン (fT3)9,10,11、慢性低酸素曝露下では徐々に回復または減少する可能性があります10,11,12。しかし、急性低気圧低酸素症（AHH）下での HPA および HPT 軸の活性化のメカニズムはまだよく理解されていません。

興味深いことに、私たちの以前の研究では、腸内微生物叢、HPA 軸、および HPT 軸のホルモンが、模擬標高 5,500 m のラットで、特に急性期に大幅に変化したことが示されました 13。スピアマン相関分析によってホルモンと腸内微生物叢の間に相関関係が見出されているものの、メカニズムはまだ完全には解明されていません。

潜在的な内分泌器官として、腸内微生物叢はシグナル伝達機能を持つ代謝産物や、短鎖脂肪酸 (SCFA)、神経伝達物質、神経活性化合物の前駆体、胆汁酸、コリン代謝産物、胃腸ホルモン、細菌成分などのホルモン特性を持つ化学物質を生成します14。、15．代謝産物は細菌によって腸内腔に分泌され、血液を通じて効果器官（脳など）に輸送されます。次に、腸内の細菌が宿主のホルモンに反応し、微生物叢の恒常性と代謝産物の生成に影響を及ぼし、宿主の病理学的状態に影響を与える可能性があります。例えば、ノルエピネフリンの上昇は、腸内の非病原性共生大腸菌や他のグラム陰性菌の増殖を刺激します16。腸内微生物組成および腸内透過性の変化は、HPA 軸および HPT 軸ホルモンにも影響を与えます17。宿主と腸内微生物叢の間のこのようなクロストークは環境ストレスの影響を受けやすい可能性があり、低酸素適応に重要な役割を果たしています。

まとめると、AHH曝露下で腸内微生物と宿主神経内分泌ホルモンとの相関関係を媒介する重要な代謝物を探索するために、腸内細菌叢、代謝物、神経内分泌の相互作用機構に関する新たな洞察が得られるだろう。そこで我々は、雄のSprague-Dawleyラットを用いて、模擬標高5500mで3日間、糞便および血清の代謝物を介した腸内細菌と宿主のHPT軸ホルモンおよびHPA軸ホルモンとの相互作用を調査し、高地集団に対する医療保護データを提供した。

対照と比較して、低酸素群の体重は有意に減少した(対照: 337.55 ± 21.74 g 対低酸素: 270.95 ± 9.88 g、t 検定、p < 0.0001)。低酸素群の食物摂取量は、急性低酸素曝露中に減少した(低酸素群の平均食物摂取量: 9.65 g/日/ラット、対照群の平均食物摂取量: 25.29 g/日/ラット)。対照と比較して、CRH (t 検定、p < 0.0001)、ACTH (t 検定、p = 0.0006)、および CORT (t 検定、p < 0.007) の血清レベルが有意に増加しました (図 1a-c)。、一方、TRH（tテスト、p < 0.0001）およびtT4（tテスト、p = 0.0058）は、低酸素グループで有意に減少しました（図1d、e）。 TSH、fT4、fT3、または tT3 レベルに有意な変化はありませんでした（補足図 1a-d、t 検定、p > 0.05）。

HPT 軸および HPA 軸ホルモンに対する 5500 m でのシミュレーション高度の影響。 CRH (a)、ACTH (b)、CORT (c)、TRH (d)、tT4 (e) の血清レベル。データは平均±SEMとして表した。 n = 6/グループ。対応のない両側 t 検定を使用した対照群との比較で、**p < 0.01、***p < 0.001、***p < 0.0001。 CRH 副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン、ACTH 副腎皮質刺激ホルモン、CORT コルチコステロン、TRH 甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、tT4 チロキシン。

97% の配列類似性に基づいて、22,248 の運用分類単位 (OTU) が特定され、38 門、99 綱、160 目、198 科、および 254 属に割り当てられました。急性低酸素曝露は、シャノン指数、チャオ 1、または観察された OTU で測定されたアルファ多様性に有意な影響を与えませんでした（図 2a、マンホイットニー検定、p > 0.05）。ブレイ-カーティス距離の主座標分析（PCoA）プロットにより、サンプルがグループ間でクラスター化し、分離していることが確認されました（図2b）。線形判別分析エフェクトサイズ (LEfSe)18 により、13 の異なる属が同定されました。ファーミクテス属とヴェルコミクロビアは、門レベルで低酸素群に有意に豊富でした（図2c、d、LDAスコア> 3、KW順位和検定およびペアワイズウィルコクソン検定、p < 0.05）。バクテロイデス、ラクトバチルス、パラバクテロイデス、ブチリシモナス、SMB53、アッカーマンシア、ファスコラルクトバクテリウム、およびエアロコッカスは低酸素グループに豊富でしたが、[プレボテラ]、プレボテラ、カイストバクター、サリニバクテリウム、およびヴォゲセラは属レベルで正常酸素グループに豊富でした（図2c、d）、LDA スコア > 3、KW 順位和検定およびペアワイズウィルコクソン検定、p < 0.05)。

模擬高度 5500 m が腸内細菌叢に及ぼす影響。 (a) 腸内細菌叢のアルファ多様性は、マン・ホイットニー検定を使用したシャノン指数によって分析されました。データは平均±SEM、n = 6/グループとして表されました。 (b) 腸内微生物群集構造の主座標分析 (ブレイ - カーティス距離) プロット。 (c) 低酸素グループ (緑のブロック) と対照グループ (赤のブロック) の間で差分的に豊富な特徴について計算された、ランク付けされた線形判別分析 (LDA) スコア (しきい値 > 3、p < 0.05) のヒストグラム、および (d) のクラドグラムマッピングLEfSe によって生成された分類ツリーに対する低酸素群 (緑色のブロック) と対照群 (赤色のブロック) の間の腸内微生物叢組成の違いは、腸内微生物組成の有意な違いを示しました。

低酸素群と正常酸素群間の糞便と血清の代謝物プロファイルの違いは、直交部分最小二乗判別分析（OPLS-DA）によって明らかになりました（図3a、b）。合計 2945 個の代謝物が糞便中に同定され、1457 個の代謝物が血清中に同定されました。多変量解析により、投影における可変重要性のカットオフ値（VIP）が1を超え、p値が0.05未満（t検定、補足図2a）である、糞便中の233の異なる代謝物と血清中の66の異なる代謝物が特定されました（t検定、補足図2a）。 5 つのグリセリルホスファチド (LysoPE(0:0/20:2(11Z,14Z))、LysoPE(0:0/24:6(6Z,9Z,12Z,15Z,18Z) など) を含む代謝産物が血清および糞便中で同時下方制御されました。、21Z))、PC(18:2(2E,4E)/0:0)、PE(16:0/18:2(9Z,12Z))、PS(P-20:0/22:4( 7Z,10Z,13Z,16Z)))、2 つの長鎖脂肪酸 (2E,5Z,8Z,11Z,14Z-エイコサペンタエン酸およびパルミチン酸)、プレノール脂質 (カジネン)、および脂肪アシル (ムリコレアシン)(補足図2b–j）。糞便および血清中のVIP値でランク付けされた上位50の差次的代謝産物の視覚化をそれぞれ図4a、bに示しました。糞便中の異なる代謝産物は、主に脂肪アシル、プレノール脂質、グリセロリン脂質、ステロイドおよびステロイド誘導体でした（図5a）。大きく変化した血清の代謝産物は主にグリセロリン脂質、脂肪アシル、およびスフィンゴ脂質でした（図5b）。注目すべきことに、血清中のグリセロリン脂質および脂肪アシル代謝産物の大部分は、急性低酸素曝露下で下方制御されました（図5b）。さらに、KYOTO Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) 経路分析を使用して、変化した血清および糞便代謝産物を代謝経路にマッピングしました。その結果、糞便と血清中で同時に変化する経路は「不飽和脂肪酸の生合成」（図5c、d、糞便代謝物：p=0.0029、血清代謝物：p=0.0349）と「脂肪酸生合成」（図5c、d）であることが判明した。 5c、d、糞便代謝物: p = 0.0292、血清代謝物: p = 0.0317)。さらに、糞便代謝産物の変化した経路には、「アラキドン酸代謝」（図5c、p < 0.0001）および「PPARシグナル伝達経路」（図5c、p = 0.0274）も含まれ、血清代謝産物には「脂肪酸分解」が豊富に含まれていました。 (図5d、p = 0.0003)および「ミトコンドリアにおける脂肪酸の伸長」(図5d、p = 0.0175)。

糞便および血清メタボロミクスに対する 5500 m でのシミュレートされた高度の影響。糞便 (a) および血清 (b) 代謝産物の直交部分最小二乗判別分析 (OPLS-DA) プロット。対照群のFC糞便、低酸素群のFH糞便、対照群のSC血清、低酸素群のSH血清。 n = 6/グループ。

糞便 (a) および血清 (b) の投影における変数重要度 (VIP) によってランク付けされた上位 50 の変化した代謝産物のヒートマップ (カットオフ値 VIP > 1 および p < 0.05 (t 検定))。

変化した代謝産物の分類と KEGG 経路分析。バタフライチャートは、糞便 (a) および血清 (b) 中の変化した代謝産物 (低酸素対対照) の分類を示しました。糞便 (c) および血清 (d) 中の示差的代謝産物の KEGG 経路解析 (https://www.kegg.jp/kegg/kegg1.html)。バブルプロットは、対応する代謝経路にマッピングされた示差的な代謝物を示しました。点線はカットオフ p 値 0.05 を示しました。バブルのサイズは、各 KEGG 経路に含まれる変化した代謝物の数を示します。 n = 6/グループ。

代謝産物は、宿主と微生物叢の相互作用において重要な役割を果たします。そこで我々は、ホルモンと腸内細菌叢との相互作用を媒介する重要な糞便および血清の代謝物を原因媒介分析（CMA）によって調査した。図6に示すように、腸内細菌叢と6つの血清代謝物および5つの糞便代謝物によって媒介されるホルモンの変化との間に有意な因果関係が確認できました。対応する平均因果媒介効果 (ACME)、平均直接効果 (ADE)、および合計効果は、オンラインの補足表 S1 として見つけることができます (p < 0.05)。

原因媒介分析により、ホルモンと腸内細菌との因果関係を媒介する潜在的な糞便および血清代謝物が明らかになりました。青い線、負の係数。赤い線、正の係数。代謝産物から細菌属およびホルモンへ、また細菌属およびホルモンから代謝産物への矢印は、これらの指標が描かれた方向に相互に影響を与えるという概念を暗示しています。 CORT コルチコステロン、TRH 甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、tT4 チロキシン。

血清 LysoPE(0:0/22:2(13Z,16Z))、PC(16:0/3:0)、1,3E,6Z,9Z-ノナデカテトラエンは、[プレボテラ] および糞便に対する TRH の悪影響を媒介する可能性があります。 3-(2,4-シクロペンタジエン-1-イリデン)-5α-アンドロスタン-17β-オールは、エアロコッカスに対するTRHのプラスの効果を媒介する可能性があります。血清カジネン、リソPE(0:0/22:5(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z))、およびパルミトレイン酸エチルエステルは、カイストバクターに対するtT4の悪影響を媒介する可能性があります。糞便オキシメステロンはパラバクテロイデスに対する CORT の悪影響を媒介する可能性があり、エアロコッカスに対する CORT の悪影響は 3-(2,4-シクロペンタジエン-1-イリデン)-5α-アンドロスタン-17β-オールによって媒介される可能性があります。

TRHに対する[プレボテラ]のマイナスの影響とエアロコッカスのプラスの影響は、同じ糞便代謝産物である抗生物質X 14889Cによって媒介されました。 Fecal Pro Val Asn Arg は、tT4 に対するカイストバクターの悪影響を媒介する可能性があります。糞便中のロバスタチン酸（メビノリン酸）は、CORT に対するエアロコッカスの悪影響を媒介する可能性があります。

神経内分泌反応障害は、5000 mを超える高地に曝露された後に発生しました。我々の研究では、高地への急性曝露を受けた雄ラットでは HPA 軸が顕著に活性化され、HPT 軸の TRH と tT4 が阻害されることが示されており、これは以前の研究と一致している 7,19,20。急性低酸素ストレスに関連する神経内分泌障害は、食欲低下の引き金として作用する可能性があります21。

さらに、急性低酸素曝露は腸管バリアの透過性 22 と腸内微生物叢の組成の変化 23 を引き起こし、その結果、高地に対する宿主の不適応と AMS の発生率を引き起こします 24。パラバクテロイデス属、アッカーマンシア属、ラクトバチルス属、バクテロイデス属の増加、およびプレボテラ属の減少は、AHH 曝露のヒトおよび動物モデルでも見られました 25、26、27、28。バクテロイデス、パラバクテロイデス、ブチリシモナス、ラクトバチルス、ファスコラルクトバクテリウム、およびアッカーマンシアは腸内共生細菌であり、そのほとんどが SCFA 産生細菌です 28、29、30。我々の結果は、低酸素グループが豊富であることを示しました。以前の研究では、プレボテラの存在量が高いことが重度の AMS 症状に関与していることが示されています 24。プレボテラは代謝 31 と免疫 32 の調節に関与していました。この状況と組み合わせると、急性低酸素曝露下での腸内細菌叢の適応変化が低酸素適応に寄与する可能性があることが示唆されるかもしれない。

蓄積された証拠は、腸内細菌群集の組成的および機能的プロファイルと神経内分泌恒常性との間の相互作用を示している 33,34,35。私たちの研究は、TRH と tT4 が、LysoPE(0:0/22:2(13Z,16Z)) (グリセロリン脂質)、PC(16:0/3:0) (グリセロリン脂質)、1,3E,6Z,9Z-ノナデカテトラエン (脂肪アシル)、カジネン (プレノール脂質)、LysoPE(0:0/22:5(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z)) (グリセロリン脂質)、およびパルミトレイン酸酸エチルエステル（脂肪族アシル）。以前の研究では、プレボテラ属が末梢甲状腺恒常性に関連し、甲状腺機能亢進症では増加し、甲状腺機能低下症では減少することが判明しました35。証拠の一部は TRH と脂質の関連を示しており 36,37 、我々の発見は TRH と tT4 が血清脂質と相関していることを示しました。腸内に非常に豊富に存在する細菌属である腸管プレボテラ属菌は、体重減少を促進し、コレステロール値を低下させる可能性があります 31。 Prevotella_9 および Prevotellaceae_NK3B31_group は、グリセロリン脂質代謝物と有意に正の相関がありました 38。 LysoPE(0:0/22:5(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z)) は一般的なリゾリン脂質 (LPL) であり、シグナル伝達機能を持っている可能性があります 39。私たちの研究は、それがtT4とカイストバクターの間の双方向の負の影響を媒介するメディエーターとして機能する可能性があることを示しました。これらの結果は、血清脂質代謝産物が脂質代謝に関与し、[プレボテラ]に対するTRHおよびカイストバクターに対するtT4の効果を媒介するシグナル伝達分子として機能する可能性があることを示している可能性がある。さらに、HPT 軸は腸内細菌叢の組成によって影響を受ける可能性があります。いくつかの研究では、腸内微生物組成がヨードチロニン代謝に影響を与える可能性があることが示唆されています40、41、42。微生物の組成が HPT 軸に影響を与えるかどうか、またどのように影響するかは、依然として複雑で冗長な問題です。私たちの研究は、腸内細菌が糞便代謝産物を介してTRHおよびtT4に影響を与える可能性があることを示唆していますが、HPT軸のエフェクターホルモンに対する急性低酸素の影響はほとんど示していません40。腸内細菌叢の組成の変化は、微生物由来の代謝産物を介して末梢 T4 および T3 代謝に影響を与える可能性があり、急性低酸素曝露下での末梢 T4 および T3 に対する阻害された TRH の効果は制限されます 35,40,43。

腸内フローラの乱れはHPA軸の活性化と密接に関係しています。さまざまな腸内細菌叢の乱れと HPA 軸の機能不全の間のコミュニケーションは、免疫、腸関門、血液脳関門、微生物の代謝産物や腸内ホルモンなどの他のシステムと密接に関連しています44。 HPA 軸の活性の増加は、腸管バリアの透過性の増加と腸内微生物叢の組成の変化につながりますが、腸内微生物叢は微生物由来の代謝産物や炎症因子を介して HPA 軸の活性化にもつながります 45。私たちの研究は、ほとんどの糞便代謝産物がエアロコッカスと TRH および CORT との相関関係を媒介していることを示唆しています。炎症を誘発する可能性がある病原体であるエアロコッカス 46 は、低酸素群で大幅に増加し、4 つの糞便代謝物と関連していました。非常に効果的なヒドロキシメチルグルタリル - コエンザイム A レダクターゼ阻害剤 47 であるロバスタチン酸は、コレステロール合成の阻害剤 48 です。これらの結果は、エアロコッカスが糞便ステロイド代謝産物と相互作用して、低酸素下でのコルチゾールの活性化と制御に関与している可能性があることもさらに示唆しています。

さらに、パラバクテロイデスは、糞便代謝産物であるオキシメステロン (ステロイド) を介して CORT の影響を受けることが判明しました。パラバクテロイデスは、酢酸塩 30 を生成することによって抗炎症性を示す細菌であり、酢酸塩 30 は急性低酸素曝露時に著しく増加します。パラバクテロイデスの存在量は、血清 CORT49 と有意に負の相関があります。いくつかの研究では、ステロイド誘導体であるオキシメステロンが、11β-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ 2 (11β-HSD2) 依存性のグルココルチコイド不活化を選択的に抑制し、11β-HSD250 のコルチゾール酸化部位に競合的に結合して、ミネラルコルチコイド受容体 (MR) の活性化を引き起こすことが判明しました。。我々の結果はさらに、パラバクテロイデスが急性低酸素曝露下でオキシメステロンを介してCORTの影響を受ける可能性があることを示唆しました。

この研究にはいくつかの制限があります。第一に、CMA 分析は、証明された因果関係ではなく、さらなる研究のための微生物叢、代謝産物、および神経内分泌間の潜在的な関連性のターゲットと方向性を示唆するだけであり、機能実験によってさらに検証する必要があります。第二に、この研究には、腸内細菌叢とAMSの神経内分泌反応の潜在的な関係に関する、高地曝露の急性期のみが含まれていました。慢性的な低酸素曝露については、さらなる研究が必要です。第三に、予備的な探索研究として、この研究で使用されるサンプルサイズはグループあたり 6 であり、結論はより推測的です。検証には引き続き機能実験研究が必要です。

要約すると、本研究は、模擬標高 5500 m における雄の Sprague-Dawley ラットにおける HPA 軸および HPT 軸ホルモンの機能不全、腸内細菌叢の乱れ、糞便および血清代謝物の変化を強調した。複数の血清および糞便代謝産物を介した腸内微生物とTRH、tT4、およびCORTとの双方向の関連は、低酸素適応において重要な役割を果たしている可能性があります。しかし、この研究は、因果媒介分析を使用したマイクロバイオームとメタボロミクスの組み合わせを通じて、神経内分泌と腸内細菌叢の間の相互作用のメディエーター代謝物を調査したものであり、この研究の結果をさらに確認するには多数の研究が必要です。

すべてのラットの実験手順は、中国医学アカデミーおよび北京連合医科大学の動物管理使用委員会によって承認され (承認番号 ACUC-A02-2022-039)、動物福祉の倫理審査ガイドライン (GB) に従って実施されました。 /T 35892-2018)。生後 10 週齢の特定病原体フリー (SPF) 雄スプラーグドーリーラット (北京威通立華実験動物技術有限公司) を、12:12 の明暗サイクル、温度 20 ± の動物室で飼育しました。 4 °C、湿度 30 ～ 60%。使用される動物の数とその苦痛を最小限に抑えるためにあらゆる努力が払われました。すべての実験は ARRIVE ガイドラインに従って実行されました。

1 週間の事前適応後、ラットをランダムに 2 つのグループに分けました。低酸素群 (n = 6) は高度 5,500 m (379 mmHg) を模倣した低圧酸素室 (FLYDWC50-IC) に入れられましたが、対照群 (n = 6) は正常酸素環境に保たれました (北京、中国、52メートル、760mmHg）。ラットに通常のマウス用飼料（300 g/d/ケージ、3.44 kcal/g、脂肪由来 12.95% kcal、Beijing Keao Xieli Feed Co., LTD.）を与え、チャンバーを 1 日あたり 20 分間開けてマウス用飼料と水を加えました。各グループの体重と総食物摂取量を記録します。低酸素および正常酸素への 3 日間の曝露後、3% ペントバルビタールナトリウムを使用して深部麻酔を行い、直腸終末便を腹部から直ちに採取し、直ちに -80 °C で冷凍しました。左心室動脈血サンプルは午前 9 時に収集されました。血清は分離され、分析されるまで -80 °C で保管されました。

甲状腺刺激ホルモン放出ホルモンの血清レベル (TRH、CSB-E08040r)、TSH (CSB-E05115r)、tT4 (CSB-E05082r)、fT4 (CSB-E05079r)、tT3 (CSB-E05085r)、fT3 (CSB-E05076r)、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン (CRH、CSB-E08038r)、副腎皮質刺激ホルモン (ACTH、CSB-E06875r)、コルチコステロン (CORT、CSB-E07014r) は、Cusabio Biotech Co., Ltd.の ELISA キットによって分析されました。すべてのホルモンは、メーカーのガイドラインに従って検出されました。。

糞便サンプル中の全 DNA (250 mg) を QIAamp® PowerFecal DNA Kit (QIAGEN、ドイツ) によって抽出しました。細菌群集の分類学的組成を分析するために、その後のパイロシーケンスのために 16S V4 ユニバーサル細菌プライマー (338F および 806R) が選択されました。すべての PCR 反応は、Phusion® High-Fidelity PCR Master Mix (New England Biolabs) を使用して実行されました。 TruSeq® DNA PCR-Free Sample Preparation Kit (Illumina、United States) をメーカーの推奨に従ってライブラリー構築に使用し、インデックスコードを追加しました。ライブラリの品質は、Qubit@ 2.0 Fluorometer (Thermo Scientific) および Agilent Bioanalyzer 2100 システムで評価されました。最後に、HiSeq2500 PE250 をオンマシンシーケンスに使用し、250 bp のペアエンドリードを生成しました。

ペアエンドリードは、固有のバーコードに基づいてサンプルに割り当てられ、バーコードとプライマー配列を切断することで切り詰められ、FLASH (V1.2.7) を使用してマージされました。生タグの品質フィルタリングは、Quantitative Insights into Microbial Ecology ソフトウェア (QIIME、V1.9.1) を使用して、特定のフィルタリング条件下で実行され、高品質でクリーンなタグが得られました。簡単に説明すると、(i) 連続した低品質の値 (しきい値 ≤ 19) が設定された長さ (しきい値 ≥ 3) に達した Raw タグを切り取ります。 (ii) 連続した高品質の基本長がタグの長さの 75% 未満であるタグをフィルタリングして除外します。 (iii) UCHIME アルゴリズムと Gold データベースを通じてキメラ配列を削除します。次に、フィルタリングされた配列は、Uparse ソフトウェア (V7.0.1001) を使用して、配列類似性 97% の閾値で代表的な配列に従って操作分類単位 (OTU) にクラスター化され、Greengenes データベースと照合して門、科、および属のレベルに分類されました。

最小シーケンス深度 (29416) に基づいて OTU をリサンプリングおよび正規化した後、アルファ多様性を使用して、シャノン、チャオ 1、観察された種、PD_whole_tree、およびシンプソンを含む 5 つの指標を通じて種の多様性の複雑さを分析しました。ベータ多様性は、OTU マトリックスが QIIME51 による累積和スケーリング (CSS) を使用して正規化された後に計算され、グラフは「vegan」パッケージを備えた R (V4.1.3) を使用して実行されました。低酸素群と正常酸素群の微生物の特徴を調査するために、線形判別分析エフェクトサイズ (LEfSe) 分析 18 が実行され、LDA スコアは 3 でした。

糞便ペレット (60 mg) および血清 (100 μL) を L-2-クロロフェニルアラニン、C-17、およびメタノールと混合して、液体クロマトグラフィー質量分析 (LC-MS) 分析用に上清を抽出しました。 ACQUITY UHPLC システム (Waters Corporation ミルフォード、米国) と AB SCIEX Triple TOF 5600 システム (AB SCIEX、マサチューセッツ州フラミンガム) を組み合わせて、エレクトロスプレーイオン化 (ESI) 正イオンモードと ESI 負イオンモードの両方で代謝プロファイリングを分析しました。 ACQUITY UPLC BEH C18 カラム (1.7 μm、2.1 × 100 mm) をポジティブモードとネガティブモードの両方で使用しました。

取得した LC-MS 生データは、以下のパラメーターを使用して、Progenesis QI ソフトウェア (Waters Corporation ミルフォード、米国) によって分析されました。前駆体許容値は 5 ppm、フラグメント許容値は 10 ppm、保持時間 (RT) 許容値は 0.02 分に設定されました。内部標準検出パラメーターはピーク RT アライメント用に選択解除され、同位体ピークは分析から除外され、ノイズ除去レベルは 10.00 に設定され、最小強度はベースピーク強度の 15% に設定されました。得られたマトリックスは、60% を超えるサンプルで欠損値 (イオン強度 = 0) を持つピークを除去することでさらに減少しました。内部標準はデータの品質管理（再現性）に使用されました。正のデータと負のデータを結合して結合データを取得し、これを SIMCA ソフトウェアパッケージ (V14.0、Umetrics、ウメオ、スウェーデン) にインポートしました。主成分分析 (PCA) および (直交) 部分最小二乗判別分析 ((O)PLS-DA) を実行して、グループ間の代謝変化を視覚化しました。デフォルトの 7 ラウンドの相互検証が適用され、過剰適合を防ぐために各ラウンドの数学的モデルからサンプルの 7 分の 1 が除外されました。モデルのスコアプロットで楕円として示されるホテリングの T2 領域は、モデル化された変動の 95% 信頼区間を定義します。投影における変数の重要度 (VIP) は、OPLS-DA モデルに対する各変数の全体的な寄与度をランク付けします。差次的代謝物は、VIP > 1 の統計的に有意な閾値と、正規化されたピーク面積の両側スチューデント t 検定からの p 値 0.05 未満に基づいて選択されました。 KEGG データベース 52 に基づいて、示差的代謝産物のパスウェイエンリッチメント分析が行われ、示差的代謝産物は KEGG ID を使用して KEGG データベースにマッピングされました。 0.05 未満の P 値は、著しく濃縮された経路です。

体重、CRH、ACTH、CORT、TRH、TSH、tT4、tT3、fT4、および fT3 の対応のないスチューデントの t 検定、およびシャノン、チャオ 1、観察種、PD_whole_tree、およびシンプソン検定のマン・ホイットニー検定は、Prism を使用して実行されました。７ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ、サンディエゴ、カリフォルニア州）を使用し、両側検定の有意性基準ｐ＜０．０５を用いて、平均±標準誤差（ＳＥＭ）として表した。

回帰分析と CMA53 には、R パッケージ「stats」と「mediate」が使用されました。私たちは、糞便または血清の代謝物（Mediator, M）が腸内細菌と血清ホルモンの間の因果関係を媒介するかどうかを調べました。因果媒介モデルに含まれる変数は、一般化線形モデル (GLM) を使用して 4 つの主要な仮定を満たす必要があります。 4 つの仮定には、(1) X は Y を有意に予測できる (Y = β0 + β1X + e1)、(2) X は M を有意に予測できる (M = β0 + β2X + e2)、(3) M は Y を有意に予測する (Y = β0 + β3M + β4X + e3) X を調整しながら、(4) X と Y の関係が弱まり、M を制御しました。低酸素症または正常酸素症の治療は、GLM の調整変数として制御されました。さらに、媒介パッケージを使用して、平均因果媒介効果（ACME、β2×β3）、平均直接効果（ADE、β4）、および合計効果（β1）を推定しました。 0.05 未満の P 値は有意な相関関係です。

現在の研究中に生成された配列データセットは、アクセッションコード PRJNA934696 で SRA データベースから入手できます。

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この研究は、CAMS 医療科学イノベーション基金 (番号 2022-I2M-JB-003) によって支援されました。

基礎医学研究所、中国医学院、北京連合医科大学基礎医学院、北京、100005、中国

Jianan Wang、Shiying Liu、Yalei Xie、Chengli Xu

中国医学科学院環境健康科学センター、北京、100005、中国

徐成麗

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CX は実験を設計し、すべてのコンテンツを批判的に修正しました。 JW はデータの分析と解釈、記事の起草と編集を行いました。 SL は記事の草稿を作成し、重要な知的内容について批判的に改訂しました。 YX は実験を実施し、サンプルを収集しました。著者全員が原稿の出版版を読み、承認していました。

Chengli Xu への対応。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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転載と許可

Wang, J.、Liu, S.、Xie, Y. 他模擬高度 5500 m への急性曝露にさらされた雄ラットにおける腸内細菌叢 - 代謝物 - 神経内分泌変化の関連分析。 Sci Rep 13、9225 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-35573-y

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受信日: 2022 年 11 月 22 日

受理日: 2023 年 5 月 20 日

公開日: 2023 年 6 月 7 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-35573-y

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