米国中西部地域の乳がん患者では、乳がんのレベルが低下しています。

Scientific Reports volume 13、記事番号: 526 (2023) この記事を引用

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地理的位置は腸内マイクロバイオームに影響を与える可能性があるため、さまざまな疾患の地域固有のマイクロバイオームの特徴を研究することが重要です。そこで、米国中西部の乳がん (BC) 患者の腸内マイクロバイオームをプロファイリングしました。腸内マイクロバイオームの細菌成分は、16S リボソーム RNA シーケンスを利用してプロファイリングされました。さらに、細菌マイクロバイオームの機能的能力を評価するために、遺伝子経路分析が実行されました。アルファ多様性は、BC と健康対照 (HC) の間で有意な差はありませんでしたが、ベータ多様性は、種および属レベルで 2 つのグループ間の明確なクラスター化を明らかにしました。ウィルコクソン順位和検定により、BC におけるいくつかの腸内細菌の調節が、フェカリバクテリウムプラウスニッツィイなどの有益な効果に関連する細菌の存在量を特に減少させていることが明らかになりました。機械学習分析により、単変量分析で見つかったいくつかの調節された細菌の重要性が確認されました。機能分析により、HCと比較してBCではSCFA（プロピオン酸）生成量が減少していることが示されました。結論として、我々は、乳癌の病理生物学におけるSCFA産生腸内細菌の役割を示唆するSCFA産生腸内細菌の枯渇を伴うBCにおける腸内細菌叢の異常を観察した。乳がんにおける腸内細菌異常症のメカニズムを理解できれば、より洗練された予防と治療につながる可能性があります。

乳がんの世界的な発生率は 1980 年代以来大幅に増加しており、この異種疾患は現在、世界中で最も多く診断されているがんとなっています 1。米国では、女性が診断するすべてのがんのほぼ 3 分の 1 が乳がんです2。乳がんに関連する危険因子は多数あり、これには環境因子（生殖歴、ホルモン補充療法、肥満など）と家族因子（BRCA1 および BRCA2 の遺伝子変異の家族歴など）の両方が含まれます3。 4,5。しかし、乳がん症例の最大 50% はこれらの既知の危険因子に起因するものではなく 6,7 、他の未知の要因も乳がんの発症につながる可能性があることを示唆しています。最近、宿主マイクロバイオームとがんとの相互作用に研究が焦点を当てていますが、これらの相互作用の性質は依然として解明されていません。胃がんのヘリコバクター・ピロリや結腸直腸がんのフソバクテリウム・ヌクレアタム4など、特定の細菌種がいくつかのがんに関連していると考えられていますが、乳がんの病理生物学に関連する単一の細菌は存在しません。

ヒトのマイクロバイオームは多くの種の細菌、ウイルス、真菌、古細菌で構成されており、推定では人体の内部および表面に少なくともヒトの細胞と同数の微生物が存在すると考えられています8。これらの微生物は人間の宿主と複雑な関係で存在しており、ホメオスタシスに不可欠です9。細菌は、人間の宿主に生息し、シグナル伝達経路の操作、ホルモン放出、DNA 二本鎖切断、アポトーシスと老化、炎症を通じて宿主と相互作用する最も豊富な微生物の代表です 3,4,10。異常なマイクロバイオーム構成である腸内細菌叢異常は、がんを含む多くの疾患状態と相関しています11。乳がん患者は乳房マイクロバイオーム 3 と腸マイクロバイオーム 3、5、10、12、13、14、15 の両方で細菌性腸内細菌叢異常を抱えていることが証拠によって示唆されています。

微生物の腸内毒素症と乳がんとの関連性は、閉経後乳がん患者（n = 11）の糞便微生物組成が健康な対照者（n = 7）と比較して有意に異なることが特定された研究で、1990 年にはすでに報告されていました12。最近の研究では、BMI または臨床がんステージに基づいて、乳がん患者の腸内微生物組成が大きく異なることが特定されました 16、17、18。ゲーデルトら。は、閉経後の乳がん患者 (n = 48) は、健康な対照 (n = 48) と比較して、アルファ多様性が有意に低いことを実証しました 19。対照的に、Zhu et al。閉経後の乳がん患者（n = 44）は、閉経後の健康な対照（n = 46）と比較して、より高いアルファ多様性を有することが観察されました20。アルファ多様性は群集の豊かさを観察するため、これらの研究は、存在する微生物の種類全体について矛盾した結果を示しています。これらの研究は大きなばらつきを示していますが、地理的位置、気象条件、集団遺伝学、食習慣、緑地などの多くの要因が腸内マイクロバイオームの組成に大きな影響を与えるため、この不均一性は驚くべきことではありません。したがって、乳がんにおけるマイクロバイオームの役割をより深く理解するには、複数の地理的地域からのデータが必要です。したがって、この研究は、米国中西部地域の乳がん患者に腸内細菌叢の異常があるかどうかを判断するために実施されました。

私たちは、ホールデン総合がんセンター (HCCC) の乳房分子疫学リソース (BMER) およびアイオワ大学の健康対照 (HC) を通じて乳がん (BC) 患者を募集しました。このパイロット研究では、人種、体格指数 (BMI)、性別が一致した HC と比較した場合、BC の腸内微生物組成に有意な差があることを報告します。

BC (n = 24) および HC (n = 23) コホートの腸内マイクロバイオームを観察するために、16S rRNA の V3-V4 領域のメタゲノム配列決定が利用されました。低品質の配列を持つ被験者と前がん患者を除外した後、さらなる分析のために BC 患者 22 名と HC 患者 19 名を用意しました。まず、ファーミクテス/バクテロイデス間の比率が腸内細菌叢異常のマーカーと考えられているため観察されました21。この比較は、生の値の差を観察するために、特徴量のフィルタリングまたは正規化の前に実行されました。この比は 2 つのコホート間で有意な差はありませんでした (p 値: 0.06241) (図 1A)。次に、属および種レベルでのグループ間の差異が分析されました。

腸内マイクロバイオームの構成は、乳がん患者と健康な対照者の間で異なります。 (a) BC および HC 患者に見られるファーミクテス/バクテロイデス比。比率は有意な差はありません (p = 0.06241)。 (b) Chao1 インデックスを利用して属の豊富さを測定しました。この比較は、BC と HC の間で有意な差はありませんでした (p = 0.111)。 (c) この測定は種レベルの分析にも利用されました。種レベルでは 2 つのグループ間に有意差はありませんでした (p = 0.129)。（ d ）加重UniFrac距離メトリックを利用して、属レベルでのベータ多様性を分析し、BCおよびHCが有意にクラスター化されました（p = 0.011）。 (e) このメトリックは、種レベルの分析にも利用され、BC と HC が再び有意にクラスター化されました (p = 0.014)。

合計で 519 種と 340 属が特定されました。これら 519 種のうち、61 種は HC のみに見られ、81 種は BC 患者のみに見られました。これら 340 属のうち、28 属は HC に特有であり、49 属は BC 患者に特有でした。濾過後、114 種と 92 属が残りました。正規化前データのアルファ多様性は、Chao1 Index を使用して測定されました。ただし、BC コホートと HC コホート間の種 (p = 0.129) または属 (p = 0.111) レベルでは有意ではありませんでした (図 1B および C)。シャノンの多様性も、種または属レベルで BC と HC の間で有意な差はありませんでした (それぞれ p = 0.344、p = 0.414)。ベータ多様性は、存在する特徴の量を評価すると同時に、これらの特徴間の系統発生的関係も含めることによって各サンプルのマイクロバイオームを比較する、加重 UniFrac 距離メトリックを利用して測定されました。ベータ多様性は、種 (p = 0.014) および属 (p = 0.011) レベルで統計的に有意であり、これは、両方のレベルで BC と HC が別々のグループに明確にクラスター化されていることからもわかります (図 1D および E)。

糞便マイクロバイオームの概要を把握するためにヒートツリーが利用されました。これにより、グループ間で細菌の特徴が富化または減少/枯渇していることが視覚的に表現されます (図 2)。最も豊富な属、科、門の全体的な概要を示すために、補足図 1 にこれらの各分類レベルの積み上げ棒グラフを含めました。これらの特徴を詳しく見ると、BC と HC で大きく異なる 16 種が明らかになりました。 Wilcoxon 符号付き順位和検定による正規化されたログ量に基づいています。重要な特徴の p 値 ≤ 0.05 および調整された p 値 ≤ 0.15 でした。 HC コホートと比較して BC コホートでより豊富に存在した注目すべき種には、Oscillospiraceae 種、Actinomyces 種、Eggerthella lenta、Faecalitalea 種、Intestinibacter bartlettii、および Blautia 種が含まれます (図 3A–F)。 HC コホートと比較して BC コホートで存在量が少ない種には、フェカリバクテリウムプラウスニツィイ、エリシペロトリカ科 UCG 003 細菌、アリスティペス種、オシリバクター種、ラクノスピラ科 UCG 010 種、ラクノクロストリジウムエドワルディ、ラクノスピラペクチノシザ、およびパラバクテロイデスメルダエが含まれます（図 4A）。 –H) 。これらの結果の完全な概要は補足表 1 にあります。

乳がん患者と健康なコントロールの間の系統的多様性の違い。このヒートツリーは、HC と BC の間の系統発生的な違いを表します。赤は HC と比較して BC の存在量が多いことを示し、青は BC の存在量が HC よりも少ないことを示します。このヒートツリーは、2022 年春の時点で更新された MicrobiomeAnalyst の Web ベースインターフェイスを使用して作成されました78,79。

乳がん患者では、健康な対照者と比較して細菌が大幅に増加しました。（a〜f）WilcoxonテストとBenjamini-Hochberg手順に基づくと、健康な対照と比較して乳がんコホートでは6つの特徴が有意に多かった（p≤0.05、q≤0.15）。有意性: * < 0.05 および ** < 0.01。

乳がん患者では、健康な対照者と比較して細菌が大幅に減少しました。（a〜h）ウィルコクソン検定とベンジャミニ・ホッホバーグ法に基づくと、乳がんコホートでは健康な対照と比較して8つの特徴の量が有意に低かった（p ≤ 0.05、q ≤ 0.15）。有意性: * < 0.05、** < 0.01、*** < 0.001。

最後に、統計的検定と生物学的一貫性および有意性を組み合わせることによって 2 つのグループを区別する特徴を特定する線形判別分析エフェクトサイズ (LEfSe) を実行しました 22。 LEfSe を使用して、HC では LDA スコアが少なくとも 3 の 5 つの特徴、BC では LDA スコアが少なくとも 3 の 15 の特徴を観察しました。 LEfSe によって同定されたすべての種は、HC と BC の間に同じ関係がある単変量検定でも同定されました (図 5)。

乳がん患者と健康な対照間の分類群を区別する。 LEfSe 分析によって選択された上位 20 の重要な機能。 LDA スコアは、各特徴の効果の大きさを示します。

ランダムフォレスト機械学習アルゴリズムを適用して、糞便マイクロバイオームの BC 表現型を予測する能力を評価しました。具体的には、500 本の木のブートストラップランダムフォレストを利用して、BC および HC サンプルに基づいた予測モデルを作成しました。サンプルがどのコホートのものであるかを特定する際に重要な上位 15 個の特徴を図 6 に示します。次に、R の Boruta23 関数を有意水準 0.01 で利用して、BC サンプルと HC サンプルを区別するのに重要な細菌種を特定しました。これら 15 の特徴のうち 9 つは重要でした (緑色で示されています)。これら 9 つの重要な種のうち 7 つも、単変量解析で有意に異なることが特定されました。単変量解析で HC と比較して BC が低いことが判明し、ランダムフォレスト解析でも重要であるとみなされた種には、Faecalibacterium prausnitzii、Parabacteroides merdae、および Oscillibacter 種が含まれます。単変量解析で HC と比較して BC が高く、ランダムフォレスト解析でも重要であると考えられた種には、Intestinibacter bartelli、Actinomyces 種、Faecalitalea 種、および Oscillospiraceae 種が含まれます。ランダムフォレスト分析に基づいて、単変量検定では重要ではない 2 つの種、ビフィドバクテリウムロンガムおよびラクノスピラ科 NK4A136 グループ種が有意であることが判明しました。

ランダムフォレストは、乳がん患者のマイクロバイオームと健康なコントロールを区別する上で重要な種を特定します。ランダムフォレスト機械学習アルゴリズムを利用して、糞便マイクロバイオームが BC と HC を区別できるかどうかを確認しました。 500 本の木のブートストラップランダムフォレストアルゴリズムを利用しました。有意性は Boruta アルゴリズムに基づいており、有意水準 0.01 が緑色で強調表示されています。

私たちのサンプルのマイクロバイオーム（メタゲノム）の機能プロファイルを推定するために、PICRUSt2（未観察状態の再構築によるコミュニティの系統学的調査）を利用しました24。このバイオインフォマティクスツールは、16S rRNA 配列を使用して、糞便サンプル中の細菌のメタゲノムを分析しました。簡単に言うと、PICRUSt2 はサンプル中の遺伝子ファミリーの存在量を推定して、メタゲノムの構成を決定します。この分析を通じて、43 の統計的に有意な経路が特定されました (補足表 2)。これらの経路のうちの 2 つは、短鎖脂肪酸 (SCFA) 代謝に関与しています。ピルビン酸のプロパン酸発酵と酢酸からのメタン生成です (図 7A および B)。したがって、我々のマーカーに基づく機能プロファイリングは、BCがHCと比較して異なる機能経路を有し、SCFAの産生に関与する経路の量が減少していることを示唆している。

腸内マイクロバイオームの機能プロファイルは、乳がん患者と健康な対照者の間で異なります。 Wilcoxon テストと Benjamini-Hochberg 法に基づくと、BC と HC では 43 の経路が大きく異なりました。短鎖脂肪酸代謝に関与する 2 つの経路、(a) ピルビン酸発酵からプロパン酸への経路、および (b) 酢酸からのメタン生成が強調されました。有意性: * < 0.05 および ** < 0.01。

腸内マイクロバイオームは、乳がんの病理生物学における潜在的な要因として浮上しています。地理的地域と環境は個々のマイクロバイオームの形成に重要な役割を果たすため、乳がん患者の糞便マイクロバイオームをプロファイルするには、地域に特化した新しい研究が必要です。この研究は、分類学的組成と予測機能プロファイリングのために、米国中西部地域の乳がん患者と健康な対照者の腸内マイクロバイオームを分析した初めての研究です。我々の結果は、BC患者においてSCFA産生腸内細菌が減少し、腸内マイクロバイオームが変化していることを実証している。

BC における腸内細菌叢の異常を示す我々のデータは先行研究と一致しており、乳がんにおける腸内マイクロバイオームの役割を示唆しています 3,5,10。 BC コホートで存在量の減少を示した 8 種のうち、6 種は SCFA を生成する (つまり、F. prausnitzii、L. pectinoshiza、および P. merdae)、または SCFA を生成する属 (つまり、Lachnoclostridium、Alistipes、および Oscillibacter) のメンバーです。。 F. prausnitzii はヒトの糞便細菌の 5% を体現しており 25,26、腸内で酪酸 (C4) を生成する主要な種です 27,28,29。ポリガラクツロン酸を発酵させてギ酸塩 (C1) と酢酸塩 (C2) を生成する L. ペクチノシザも 30、BC コホートで存在量の減少を示しました。最後に、酢酸 (C2)31 を生成する P. merdae は BC コホートで減少しました。

ラクノクロストリジウム、アリスティペス、オシリバクターはすべて SCFA 産生に関連する属です。 Lachnoclostridium symbiosum は酪酸 (C4)32 を生成し、Alistipes は少量の酢酸 (C2)、吉草酸 (C5)、プロピオン酸 (C3)、および酪酸 (C4)33 を生成し、Oscillibacter valericigenes および Oscillibacter ruminantium は吉草酸 (C5)34 と酪酸を生成します。 (C4)35、それぞれ。私たちのBCコホートで減少したAlistipesとOscillibacterの種は未分類でしたが、系統発生的に類似した種の特性により、潜在的なSCFA産生種です。 L. edouardi は L. symbiosum と系統発生的に関連しており (16S rRNA 遺伝子配列同一性は 94.26%) 36、したがって、我々の BC コホートにおける追加の SCFA プロデューサーの減少を示唆しています。

大腸では、SCFA は非消化性炭水化物の主要な細菌発酵代謝物です。ヒトの腸内マイクロバイオームでは、SCFA は主に酢酸塩 (C2)、プロピオン酸塩 (C3)、酪酸塩 (C4) 37 ですが、ギ酸塩 (C1) や吉草酸塩 (C5) も含まれます。 SCFA の変化は、さまざまな炎症状態 (例、多発性硬化症、炎症性腸疾患、肥満) に関連している可能性があります 38、39、40。さらに、SCFA が結腸上皮の完全性の調節、脂肪細胞の脂肪分解、および免疫系の調節を介して恒常性にとって重要であることを示す証拠があります 41。 SCFA の効果の多くは、G タンパク質共役受容体 GPR43 および GPR4142 を介して媒介されると考えられます。乳がんに特異的な SCFA は、MCF-7 ヒト乳がん細胞株の GPR41 および GPR43 を介したシグナル伝達経路を活性化します 43。これらの受容体は、健康な乳房組織と比較した場合、浸潤性乳がんおよび悪性度の高いトリプルネガティブ乳がんにおける発現の低下が実証されています 44。

対照的に、SCFA 産生に関連する 2 つの種 (Intestinibacter bartletti および Faecalitalea 種) は BC コホートで大幅に濃縮されました。 I. bartletti は酢酸塩 (C2)、吉草酸塩 (C5)、および酪酸塩 (C4) を生成し 45、Faecalitalea は酪酸塩 (C4) を生成します 46。私たちのBCコホートで濃縮されたFaecalitaleaの未分類の種は、潜在的なSCFA産生種です。これらのSCFA産生細菌は、BCコホートに豊富な細菌および/またはそれらによって産生されるSCFA代謝物が炎症経路に供給されることに依存している可能性があります。全体として、BC コホートでは、SCFA 産生細菌が濃縮されている細菌よりも大幅に減少している細菌の方が多くなっています。これらの結果は、我々のBCコホートにおけるSCFA産生細菌の腸内細菌叢異常が乳がんの病理生物学に影響を与えている可能性があることを示唆している。

我々は、43 の有意に異なる豊富な機能経路を特定しました。興味深いことに、ピルビン酸発酵からプロパン酸 I への経路は BC コホートで大幅に減少し、酢酸からのメタン生成経路は BC コホートで大幅に増加しました。これらの変化により、SCFA が減少し、腸内メタンが増加します。これまでの研究では、腸内メタンの増加が多発性硬化症や過敏性腸症候群などの炎症性疾患と関連付けられている47,48。腸内の微生物 SCFA は結腸のセロトニン生成を増加させ、胃腸の運動性を促進します 49。したがって、SCFA の減少は腸の運動性を低下させ、腸内メタンの増加も腸内通過を遅くします 50,51。この腸内輸送の減少により、栄養素の吸収が増加し、体重増加と肥満につながると考えられています52。肥満は全身性炎症の一因となり 53、閉経後の女性の乳がん発症リスクを高めます 54,55。したがって、SCFA産生細菌の量の減少は、セロトニンの調節による炎症の誘発を通じて乳がんの原因となる可能性があります。

SCFA産生細菌に加えて、Eggerthella lentaおよびBlautia属の種が、HCと比較してBC患者において有意に豊富であった。 E. lenta の濃縮は、大腸炎 56 や多発性硬化症 57 などのさまざまな炎症状態と関連しています。疾患におけるブラウティアの役割は、この属の枯渇と富化の両方が炎症状態と関連しているため、より議論の余地がある（例：クローン病58、結腸直腸癌59、および多発性硬化症60の患者におけるブラウティアの枯渇、多発性硬化症患者におけるブラウティアの富化）。硬化症48および炎症性腸症候群61)。

この研究では、米国中西部の乳がん患者の地域固有の微生物組成を特定することを目的としました。地理が腸内マイクロバイオームに影響を与える可能性があることは、米国出身者のマイクロバイオーム構成が他国と比較して異なることが示された研究で強調されているように、十分に確立されています62。私たちの研究と比較して、Yetsunenko et al。彼らは、マラウイやベネズエラの成人と比較して、米国の大都市圏の成人では未確認種のアリスティペスの数が増加していることを確認しました62。この研究では、BC コホートにおいて未確認のアリスティペスの種の存在量が減少していることを確認しました。米国の健康な成人において未確認の種のアリスティペスが増加しているため、これは米国特有の腸内毒素症を示している可能性があります。

腸内微生物組成の大陸内地域特有の違いを属レベルまたは種レベルで調査した研究はほとんどありません。以前、Chen et al. 彼らは、腸内マイクロバイオーム研究のための中西部参照集団を確立するために、性別、人種、BMI、年齢、アルコール摂取、喫煙によって異なる中西部の被験者118人の腸内微生物組成を分析しました63。私たちの研究に関連して、彼らは、フェカリバクテリウム属、パラバクテロイデス属、ラクノスピラ属、およびブラウティア属が、この中西部の健康な集団で最も蔓延している属の一部であることを発見しました63。私たちの研究では、中西部のBC州の患者では、これらの属内の種の存在量が大きく異なることが判明しました。具体的には、BC コホートでは、フェカリバクテリウムプラウスニツィイ、パラバクテロイデスメルダエ、ラクノスピラペクチノスシザの存在量が減少し、未確認のブラウティア種の存在量が増加しました。重要なことに、この地域固有の参照集団では、年齢に基づくアルファまたはベータの多様性に有意な差が見られませんでした63。このことは、米国中西部地域では成人の年齢が微生物の多様性にあまり関与していない可能性があることを示唆しています。

結論として、このパイロット研究は、SCFA産生細菌の存在量の減少、プロピオン酸塩の生成の減少、および酢酸塩のメタンへの変換の増加を伴う、BCコホートにおける腸内毒素症を示しました。私たちの発見は、SCFA を産生する糞便細菌の量の減少が乳がんの病理生物学に寄与する可能性があるという仮説を裏付けています 64。検体保管などの技術的な問題により、糞便SCFAの測定はできませんでした。以前の研究では、SCFA は大気と接触すると便から蒸発することが示されているため、SCFA レベルを測定する場合は、サンプルを直ちに適切に保管する必要があります 65。将来の研究では、同様の研究で以前に行われたように、乳がん患者の便サンプル中のSCFAの量を測定して、これらの所見を確認する必要があります15。乳がんにおける腸内細菌叢の役割をより深く理解できれば、より洗練された予防、治療、予後が得られる可能性があります。

この研究の限界としては、サンプルサイズが小さいこと、健康な対照者の閉経状態に関する情報が不足していること、コホートの年齢に大きな差があること、さまざまな治療法がマイクロバイオームに及ぼす影響の可能性などが挙げられます。サンプルサイズが小さいため、乳がんのサブタイプごとに層別化することはできませんでしたが、今後の研究では、この分析を可能にするのに十分な規模のコホートを募集することを目指す必要があります。

私たちのBCコホートはHCコホートよりもかなり高齢でした。私たちの2つのコホート間の腸内微生物組成の違いには年齢も関与している可能性がありますが、中年以降の微生物組成における年齢の役割については研究が対立しています。ゴーシュら。 2500人のコホートを研究したところ、高齢者は若年者や中年者と比較した場合、疾患状態（炎症性腸疾患、結腸直腸癌、肝硬変、II型糖尿病、ポリープなど）との関係において、特定の分類群の存在量に差があることが判明した。高齢者66．対照的に、de la Cuesta-Zuluaga et al. は、米国、英国、およびコロンビアのコホートにおける健康な女性の微生物の多様性が年齢とともに増加し、40歳前後で頭打ちになることを実証しました67。同じ研究で、中国のコホートは67歳までに階層化された場合、微生物の多様性に影響を及ぼさなかった。これらの研究は、40歳以降、年齢は一部の疾患状態の微生物叢に何らかの役割を果たしている可能性があるが、健康な対照者の微生物叢には重要な役割を果たしていないように見えることを示唆しています。年齢、病気、マイクロバイオームの相互作用をより深く理解するには、この分野でのさらなる研究が必要です。

私たちは、化学療法と放射線がマイクロバイオームに影響を与えることを認めています。この研究では、すべてのBC患者のサンプル採取の少なくとも145日前に化学療法治療が終了しました。現時点では、化学療法がマイクロバイオームに長期的な影響を与えるかどうかは不明です。放射線療法はサンプル採取の少なくとも31日前に終了し、乳房内の腫瘍を標的としたため、腸内微生物叢を免れたと考えられる。さらに、BC 対 HC 分析の前に、化学療法を受けている BC (n = 4) と化学療法を受けていない (n = 18) の BC のマイクロバイオーム、および放射線療法を受けている BC (n = 9) と放射線療法を受けていない (n = 13) のマイクロバイオームを比較しました。 BC コホート内のこれらの治療法間では、アルファおよびベータの多様性に有意な差はなく、また、どの種または属にも有意な差があることが確認されていないことが判明しました。したがって、我々の予備調査では、化学療法または放射線が腸内微生物叢に影響を与えた場合、それらの変化はこの分析の時点までに沈静化しており、したがってHCと比較した場合、これらの治療法に基づいてBCサンプルをさらに分割する必要はないことが示唆されました。

また、ホルモン療法がマイクロバイオームに影響を与える可能性があることも認めています。この研究でBC患者が受けたホルモン療法は、選択的エストロゲン受容体モジュレーター（SERM、つまりノルバデックス）とアロマターゼ阻害剤（つまりアリミデックス、アロマシン、フェマーラ）でした。腸内マイクロバイオームは循環エストロゲンレベルを調節し68、SERMは特定の腸内細菌種に対して有毒です10。私たちの知る限り、私たちの研究で重要であることが判明した細菌は、SERM の影響を受けることは示されていません。しかし、腸内微生物叢に対するアロマターゼ阻害剤の具体的な効果は十分に確立されていません10。今後の研究では、腸内マイクロバイオームと乳がんの関係についての理解を強化するために、これらの欠点に対処する必要があります。

この研究は、アイオワ大学治験審査委員会（米国アイオワ州アイオワ市）によって承認されました。 BC 患者 (n = 24) は、HCCC の BMER から募集されました。対象基準は、あらゆるステージおよび年齢 18 ～ 90 歳の浸潤性乳がんと診断されたことです。除外基準は、サンプル収集中の抗生物質の使用、および浸潤癌を併発していない前癌性または上皮内乳房疾患であった。 BC 患者については、肥満指数 (BMI)、人種、年齢、リンパ節の状態、更年期の状態、受けた治療の種類と日付、がんの病期に関するデータが収集されました。すべてのBC患者について、化学療法治療はサンプル採取の145日以上前に終了しており、最新の放射線治療はサンプル採取の31日以上前に終了していました。 BC患者のうち、22人はサンプル採取時にホルモン療法を受けていた。

HC (n = 23) はアイオワ大学看護学部を通じて採用されました。参加基準は 18 ～ 90 歳の女性でした。除外基準は、サンプル採取後 4 週間以内の抗生物質または下剤の使用、および 3 か月以内の結腸内視鏡検査でした。健康な対照については、BMI、人種、年齢に関するデータが収集されました。

1 人の BC 患者と 4 人の HC は配列の質が低いため解析から除外され、1 人の BC 患者は前癌病変のために除外されました。その結果、22 人の BC 患者と 19 人の HC 患者が発生しました。被験者の特徴を表 1 に示します。

便サンプルは、私たちの研究室が提供する便器検体収集キット（米国ペンシルベニア州フィッシャー）を使用して患者によって収集されました。便サンプルは氷上で発送され、収集から 24 時間以内に受け取りました。便は小分けされ、受け取ってから 24 時間以内に -80 °C で保存されました。サンプルからの糞便 DNA 抽出には、Qiagen DNeasy PowerLyser PowerSoil Kit (Qiagen、メリーランド州ジャーマンタウン) を利用しました。メーカーの指示に従い、ビーズ叩解ステップを実行しました (PowerLyzer 24 ホモジナイザー、オムニインターナショナル、米国)。 16S rRNA の V3-V4 領域の配列決定は、我々の研究室によって以前に記載されているように実行されました69。

我々は、細菌の 16S rRNA の V3-V4 領域と DADA2 パイプライン 70 を利用して、糞便サンプルの生の配列データを処理しました。簡単に言うと、プライマーを削除し、Phred 品質スコア 25 に基づいて残りの配列を切り詰め、その後リードのノイズを除去しました。不正確な塩基呼び出しを排除するためにノイズ除去が使用されました。次に、ペアになったリードをマージし、キメラを除去しました。残りの配列はアンプリコン配列変異体 (ASV) を生成しました。これらの ASV に分類を割り当てるために、Silva データベースが利用されました (バージョン 138.1、2021 年 3 月リリース)71。分類の割り当て後、リード深度が低い（つまり 27,000 リード未満）ため 1 つの BC サンプルと 4 つの HC サンプルが削除され、22 人の BC 患者と 19 人の HC 患者となりました。残りのサンプルには 27,000 ～ 86,874 カウントがあり、サンプルあたりの平均は 64,265 カウントでした。

マイクロバイオームの考えられる機能を特定するために、クリーン化された配列データを、対応する FASTA 配列ファイルを含む ASV テーブルに変換する DADA2 のツールを利用しました。次に、PICRUSt224 を使用して、潜在的な機能経路を予測しました。

分析と図の作成には R (バージョン 4.0.3)72 を利用しました。現在の特徴のアルファ多様性、ベータ多様性、および差分存在量分析は、phyloseq73、microbiomeMarker74、vegan75、および ggpubr76 を利用した社内スクリプトを使用して実行されました。データは、サンプルレベルで100万リードに合計スケーリングし、細菌レベルでlog（底10）変換することによって正規化されました。普及率が 20 未満で相対存在量が 1e-4 未満の特徴もフィルターで除外されました。これらのカットオフは、一方のグループにはその特徴が存在せず、もう一方のグループにはわずかに存在することによる重要性の不正確な主張を排除するために選択されました。合計で 519 種と 340 属が特定されました。濾過後、114 種と 92 属が残りました。経路分析では、相対存在量閾値が 0.0001 (組成パーセント) 未満の経路が除外されました。アルファ多様性は、Chao1 インデックスとシャノン多様性を利用して測定されました。差分存在量分析では、Wilcoxon 符号付き順位検定で有意性を測定し、調整された p 値を Benjamini-Hochberg アルゴリズムで計算しました。ベータ多様性については、加重 UniFrac 距離メトリックが利用され、サンプルクラスタリングの重要性が PERMANOVA によって特定されました。 LEFSe は、microbiomeMarker R パッケージの関数 run_lefse を利用して実行されました。ランダムフォレストは、R のrandomForest77 関数と Boruta23 関数を使用して実行されました。ランダムフォレスト分析の詳細については、「ランダムフォレストは、乳がん患者のマイクロバイオームと健康なコントロールのマイクロバイオームを区別する際の重要な種を特定する」セクションを参照してください。 LEFSe は一般的に使用される差分分析手法ですが、ランダムフォレストは機械学習ベースのアプローチです。 LEFSe は、一方のグループで他方のグループと比較して量が大幅に増加している分類群を特定し、同時に各特徴の効果サイズも計算します。一方、ランダムフォレストは、多くのデシジョンツリーとバギング (デシジョンツリーの多数決) を利用して、どの機能がグループの差別化に最も役立つかを決定します。したがって、両方の非常に異なるアプローチを適用し、両方で同じ特徴を見つけることにより、重要であると特定された特徴にさらに自信をもつことができます。

ヒートツリーは MicrobiomeAnalyst で作成されました 78,79。最小特徴数は 20 に設定され、各サンプルの有病率は 20 に設定され、四分位範囲に基づいて特徴の 10% が削除されました。総和スケーリングを使用して特徴データを正規化し、ヒートツリーを作成しました。

この研究は、1964 年のヘルシンキ宣言およびその後の修正に定められた倫理基準または同等の倫理基準に従って実施されました。研究標本および/または臨床データは、アイオワ大学ホールデン総合がんセンターの「乳房分子疫学リソース」(BMER)、治験審査委員会が承認した生体標本リポジトリおよびデータレジストリ (IRB 201003791) を通じて入手しました。

研究に含まれたすべての個々の参加者からインフォームドコンセントが得られました。

16S マイクロバイオームデータは、BioProject ID: PRJNA872152 で Sequence Read Archive (SRA) にアップロードされ、無料で公開されています。残りのデータは、責任著者に連絡することで入手できます。

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この出版物で報告された研究は、ホールデン総合がんセンター、国立がん研究所/国立衛生研究所の生物標本調達および分子疫学リソースコア (BioMER) によって促進されたホールデンプログラムでの患者強化研究協力プログラム (IRB 201708847) によって支援され、受賞番号に基づいて行われました。 P30CA086862。 National Institutes of Health/NIAID 1RO1AI137075 (AKM)、退役軍人功績賞 1I01CX002212 (AKM)、アイオワ大学環境健康科学研究センター、NIEHS/NIH P30 ES005605 (AKM)、P. Heppelmann および M からの寄贈からの資金提供を認めます。 Wacek (AKM)、Carver Trust Pilot Grant (AKM)、および生体触媒・生物処理センター (CBB) (AKM) からのパイロット賞、RLS はアイオワ大学の情報学フェローシップによって支援されました。 JEK は、国立衛生研究所の助成金 (アイオワ大学医学者研修プログラムへの T32 GM139776) によって支援されました。

Rachel L. Shrode、Jessica E. Knobbe、Nicole Cady の著者も同様に貢献しました。

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レイチェル・L・シュロード＆アシュトーシュ・K・マンガラム

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ジェシカ・E・ノブ

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ニコール・キャディ、ミータ・ヤダヴ、アシュトーシュ・K・マンガラム

ミシガン大学微生物学および免疫学部、アナーバー、ミシガン州、48109、米国

ニコール・キャディ

アイオワ大学歯学部、アイオワ市、52242、米国

ミータ・ヤダフ & アシュトーシュ・K・マンガラム

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ジェミー・ホアン & キャサリン・チャーウィン

ホールデン総合がんセンター、アイオワ大学病院およびクリニック、アイオワ州アイオワ市、52242、米国

メリッサ・カリー

アイオワ大学内科、アイオワ市、アイオワ州、52242、米国

ローハン・ガルジェ & プラヴィーン・ヴィカス

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ソニア・サグ

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スネハ・ファドケ

Cytonus Therapeutics、米国カリフォルニア州カールスバッド

エドワード・フィラルド

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アシュトシュ・K・マンガラム

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AKM、MY、CC、MC、PV.、SS、SP、EF、RG が研究の構想と設計に貢献しました。材料の準備とデータ収集は NC、MY、JH によって実行されました。データ分析は RLS によって実行されました原稿は RLS と JK によって書かれましたすべての著者が最終原稿を読んで承認しました。

アシュトーシュ・K・マンガラムへの通信。

AKM は、自己免疫疾患の治療に Prevotella histicola を使用すると主張する技術の発明者の 1 人です。 AKM はメイヨークリニックからロイヤルティを受け取りました (Evelo Biosciences が支払い)。ただし、この研究では特許からの資金や製品は使用されませんでした。他のすべての著者は、利益相反の可能性がある商業的または金銭的関係を一切宣言していません。

シュプリンガーネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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Shrode、RL、Knobbe、JE、Cady、N. 他米国中西部地域の乳がん患者は、短鎖脂肪酸を産生する腸内細菌のレベルが低下しています。 Sci Rep 13、526 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-27436-3

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受信日: 2022 年 10 月 18 日

受理日: 2023 年 1 月 2 日

公開日: 2023 年 1 月 11 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-27436-3

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米国中西部地域の乳がん患者では、乳がんのレベルが低下しています。