エストロゲンは妊娠中および閉経期の骨の血管の健全性を強化します

Nature Cardiovascular Research volume 1、918–932 ページ (2022)この記事を引用

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メトリクスの詳細

哺乳類の骨格系は、構造、機能、老化、病気の発生率において性差を示します。 生理学的、再生的、および病理学的骨機能における血管の役割は、血管の性特異性を理解するために必要であることを示しています。 この研究では、マウスにおいてエストロゲンはエストロゲン受容体アルファ (ERα) および G タンパク質共役エストロゲン受容体 1 (GPER1) を介して妊娠および閉経期の血管生理を制御するが、ERβ 依存性シグナル伝達は制御しないことを発見しました。 エストロゲンは、骨内皮細胞 (BEC) の脂質利用を調節し、脂肪細胞の脂肪分解と微小環境からの脂肪酸 (FA) の取り込みを促進します。 エストロゲンが低下すると、内皮 FA 代謝が歪んで過酸化脂質 (LPO) が蓄積し、血管の老化が起こります。 女性の BEC における鉄イオンレベルが高いと、LPO の蓄積が強化され、老化プロセスが加速されます。 特に、高齢マウスにおいてリプロクススタチン-1を使用してLPO生成を阻害すると、骨の健康状態が大幅に改善されました。 したがって、我々の発見は、BECに対するエストロゲンの影響を実証しており、LPOターゲティングが女性の血液と骨の健康を管理するための効率的な戦略である可能性があることを示唆しています。

思春期、妊娠、閉経期における骨格系の変化は、生理学的および病理学的な骨のリモデリングを直接的または間接的に制御する性ホルモンによって制御されます1、2。 間葉細胞および造血細胞に対する性ホルモンの役割はよく知られています 3,4。 血管の機能は、発育、修復、老化、病気を制御することで骨格生理学において中心的な役割を果たしているにもかかわらず 5,6,7 、性別間でどの程度異なるのかについては十分に理解されていないままです。 この研究では、妊娠中と閉経期の血管の変化、および BEC の成長と老化の仲介におけるステロイド ホルモンの役割を調査しました。

妊娠中の母体の骨微小環境（BM）の細胞変化を理解するために、改良された画像法を使用して、交尾後（dpc）のさまざまな日に妊娠マウスの脛骨を分析しました8。 エンドムチン (Emcn) と CD31 を使用して血管を標識し、オステリックスを使用して初期骨芽細胞系列 (OBL) 細胞をマークし、ペリリピンを使用して BM 内の脂肪細胞を識別しました。 CD31high/Emcnhigh を発現する H 型毛細血管は、骨の骨形成をサポートする血管新生血管です 9,10。 同腹子の処女、雄、および他の妊娠段階と比較して、10.5dpcの妊娠中の母動物の骨では、H型血管とOBL細胞の顕著な増加と脂肪細胞の減少が観察されました（図1aおよび拡張データ図1a、b）。 総 CD31 + CD45 - Ter119 - 内皮細胞 (EC)、総 EC 内の CD31high/Emcnhigh (H 型) EC、および増殖 (Ki-67+) EC の割合の増加により、10.5 dpc での血管新生の促進が確認されました (図 1b、図 1b、拡張データ図 1c および補足図 1)。

a、マウスの妊娠中および出産後のさまざまな時点での母体の骨におけるH型(Emcnhigh/CD31high)血管変化の代表的な共焦点画像。 妊娠時点は性交後日数 (dpc) で表され、出産後日数は分娩後日数 (dpp) で表されます。 スケールバー、40μm。 b、aに記載したH型血管の定量化。H型ECの面積を骨幹端の面積（mp）に対して正規化したもの（n = 5）。 総 EC (CD31+CD45−Ter119-) および H 型 EC (CD31high/Emcnhigh) はフローサイトメトリーによって特徴付けられます (n = 5)。 データは、画像定量化の場合は平均 ± SD、フローサイトメトリー データの場合は平均 ± SEM です。 Tukey の検定による一元配置分散分析。 c、VCDモデルにおけるH型血管の減少を示す、ビヒクルおよびVCD（n = 5）モデルマウス（20週齢）の代表的な共焦点画像。 スケールバー、40μm。 グラフは、mp の面積に対して正規化された H 型 EC の面積と、フローサイトメトリーによって定量化された総 EC を示します。 データは、画像定量化の場合は平均 ± SD、フローサイトメトリー データの場合は平均 ± SEM です。 対応のない両側 t 検定。 d、H型ECの定量化および面積定量化によるホルモン治療時の雄および雌マウス（P28）のH型血管の変化を示す代表的な共焦点画像（n = 5）。 フローサイトメトリー (ビヒクル n = 5 F、n = 7 M; E2 n = 8 F、n = 7 M; P4 n = 5 F、n = 5 M; DHT n = 5 F、n = 5 M)。 データは、画像定量化の場合は平均 ± SD、フローサイトメトリー データの場合は平均 ± SEM です。 Tukey 検定を使用した二元配置分散分析。 スケールバー、40μm。 F、女性。 M、男性。

ソースデータ

閉経期におけるBMの細胞変化を理解するために、我々は12週齢の雌にビニルシクロヘキセンジエポキシド（VCD）を注射して閉経期マウスモデルを作製した。 20日間のVCDの注射と32日後の分析により、卵胞の完全な枯渇が確認され（補足図2）、これはヒトの閉経状態をモデル化した11、12。 閉経マウスの骨では、OBL細胞の減少と脂肪細胞の増加に加えて、総BECおよびH型BECの減少が示されました（図1c）（拡張データ図1d）。 これらの発見は、妊娠と閉経がBM内の内皮区画と間葉区画に重大な変化を引き起こしたことを示しています。

これらの細胞変化における性ホルモンの寄与を理解するために、性ホルモンのエストラジオール (E2; 17β-エストラジオール、1 日あたり 2 μg)、プロゲステロン (P4; 1 日あたり 1 μg)、およびジヒドロテストステロン (DHT; 1 日あたり 100 μg) を投与しました。若い雄と雌のマウスに 10 日間実験し、2 週間後に BM を分析しました。 E2による全身治療により、骨髄区画にH型毛細血管が蓄積しました。 P4投与およびDHT投与の骨と比較して、男女の骨において総ECおよびH型ECの頻度が高いことが観察されました（図1dおよび拡張データ図1e）。 E2処理骨のOBL細胞の増加と脂肪細胞の減少は、細胞の変化が妊娠に関連した変化と類似していることを示した。 OBL細胞はDHT処理でわずかな増加を示しましたが、脂肪細胞はP4処理とDHT処理の両方で変化しませんでした（拡張データ図2a）。 H 型毛細血管に加えて、E2 は、E2 処理骨における細動脈 (CD31+Emcn- 血管) および経皮質血管 (TCV) を促進しました。 毛細血管のサブタイプは、P4 および DHT 処理でも変化しませんでした (拡張データ図 2b)。 5-エチニル-2'-デオキシウリジン（EdU）標識とKi-67免疫染色を使用したEC増殖の分析により、E2処理骨におけるEdUの取り込みとKi-67+ ECの頻度の増加が示されました。 同様に、培養初代BECは、E2処理（10μM）によりin vitroでの増殖の増加を示しました（拡張データ図2c、d）。 また、血管新生を理解するために、精製されたBECにおける血管新生因子の転写レベルも分析しました。 ビヒクル対照と比較して、E2処理BECにおける既知の血管新生調節因子のより高い発現は、E2レベルの上昇による骨における血管新生の促進を裏付けた（拡張データ図2e）。 妊娠のさまざまな段階での E2 レベルの定量化 (拡張データ図 3a) により、10.5 dpc の妊娠した母動物における内因性エストロゲン レベルの上昇が、骨の血管新生の状態に対応していることが確認されました。 同様に、マウスでは加齢により循環E2レベルが減少しました（拡張データ図3b）。 全身性低 E2 条件下での骨の血管変化を研究するために、卵巣摘出 (OVX) マウス モデルを使用しました。 卵巣摘出術は、循環 E2 レベルを低下させ、骨損失を促進する確立された方法です 13。 生後8週目の雌マウスに卵巣摘出術を実施し、6週間後に骨を分析した。 OVX マウスは、卵胞枯渇と同様の血管表現型および間葉表現型を示しました。 E2投与によるOVXマウスの骨表現型の回復により、この表現型におけるエストロゲンの中心的な役割が確立されました（拡張データ図3c）。 また、薬理学的アロマターゼ阻害剤レトロゾールを使用してエストロゲン合成を阻止し、循環 E2 レベルを低下させました。 マウスにレトロゾール（1日あたり100μg）を投与すると、血管新生のH型毛細血管とOBL細胞が減少し、発育中の骨の脂肪細胞が増加しました（拡張データ図3d）。 これらの発見により、骨内の血管の成長の調節におけるエストロゲンの役割が確立されました。

エストロゲンによって媒介される内皮特異的変化を研究するために、BEC における ER シグナル伝達を調査しました。 新たに単離されたBECにおけるERの転写物分析は、両性においてEsr1（ERα）、Esr2（ERβ）およびGper1（GPER1）の発現を示した（拡張データ図4a）。 私たちは、BEC の個々の受容体を標的とすることにより、血管成長における ER の機能を研究しました。 我々は、loxP に隣接する Esr1 (Esr1lox/lox)14、Esr2 (Esr2lox/lox)15、または Gper1(Gper1lox/lox)16 対立遺伝子と Cdh5(PAC)-CreERT2 マウス系統を使用して、誘導性 EC 特異的機能喪失マウスを作製しました17。 血管の変化を理解するために、出生後（生後 4 週間）の男性と女性の骨を分析しました。 遺伝子欠失は、対照および変異マウスからの精製BECにおける受容体転写レベルの定量化によって確認された(拡張データ図4b)。 1 つの受容体の欠失は、BEC における他の受容体の転写レベルに最小限の影響を示しました (拡張データ図 4b)。 EC 特異的な Esr1 および Gper1 の機能喪失により、総 EC および H 型 EC が減少しましたが、Esr2 変異体は雌雄ともに内皮表現型を示さなかった（図 2）。 したがって、ER Esr1 および Gper1 を阻害すると、骨内の血管の成長が損なわれました。 また、Esr1 および Gper1 変異体では OBL 数の減少と脂肪細胞の増加も観察されました (拡張データ図 4c)。 臓器全体のレベルでの変化を理解するために、Esr1 および Gper1 変異骨のマイクロ コンピューター断層撮影 (マイクロ CT) 解析を実行しました。 マイクロCTデータにより、両方の内皮変異体の海綿骨の減少と脂質含有量の増加が確認されました（拡張データ図5a、b）。 さらなる分析により、これらの内皮変異体では皮質骨の厚さと面積が変化していないことが示されました。 同様に、骨表面の破骨細胞は、EC 上の ER の欠失によっても変化しませんでした。 骨軟骨界面に存在する破骨細胞のサブタイプである血管関連破骨細胞は、血管新生血管に依存しています18。 骨幹端における血管関連破骨細胞18の減少は、これらの変異体における欠陥のある血管成長を裏付けました（拡張データ図5a、b）。 これらの発見は、BEC における ER シグナル伝達の機能的役割と BM における変化を実証しました。

マウスの P28 における ER (Esr1、Esr2、および Gper1) の内皮特異的欠失による H 型 (Emcnhigh/CD31high) 血管変化の代表的な共焦点画像。 グラフは、Esr1 (コントロール n = 11 F、n = 7 M、変異体 n = 9 F、n = 6 M)、Esr2 (コントロール n = 4 F) のフローサイトメトリーによる総 EC (CD31+CD45-Ter119-) の定量を示します。 、n = 4 M; 変異体 n = 6 F、n = 5 M)、Gper1 (コントロール n = 6 F、n = 8 M; 変異体 n = 6 F、n = 7 M)。 Esr1 (コントロール n = 11 F、n = 7 M; 変異体 n = 9 F、n = 6 M)、Esr2 (コントロール n = 4 F、n = 4 M;変異体 n = 6 F、n = 5 M）、Gper1（コントロール n = 6 F、n = 8 M、変異体 n = 7 F、n = 10 M）。 Esr1 (コントロール n = 11 F、n = 7 M; 変異体 n = 9 F、n = 6 M)、Esr2 (コントロール n = 4 F、n = 4 M) の MP 面積に正規化された H 型 EC 面積の定量化; 変異体 n = 6 F、n = 5 M）、Gper1（コントロール n = 6 F、n = 6 M; 変異体 n = 6 F、n = 9 M）。 データは、画像定量化の場合は平均 ± SD、フローサイトメトリー データの場合は平均 ± SEM です。 Tukey 検定を使用した二元配置分散分析。 スケールバー、40μm。 F、女性。 M、男性。 MP、骨幹端。

ソースデータ

雌マウスと雄マウスの両方におけるBMおよび同様の内皮ER変異表現型におけるエストロゲン媒介変化は、BECにおける性差を調査することに我々に興味をそそられた。 我々は、性差を理解するために、2、12、および65週齢の雌および雄マウスの精製BECに対してRNAシーケンス（RNA-seq）分析を実行しました。 成長と老化のさまざまな段階での遺伝子発現解析により、内皮の性差における加齢に伴う変化が得られると考えられます。 主成分分析（PCA）により、男性と女性のECが2つのクラスターに分離され、すべての年齢層での性別間のばらつきが示されました（図3aおよび補足データセット1）。 BEC トランスクリプトームの性差は年齢とともに増加し、Padj < 0.01 有意水準 (図3b)。 年齢グループ間のDE遺伝子の重複は著しく低く、成体マウスと高齢マウスの間で検出された72個の遺伝子の最も高い重複が観察されました（図3cおよび拡張データ図6a）。 遺伝子発現データの重要性を理解するために、65 週間のデータの DE 遺伝子のパスウェイ分析に一般的に適用可能な遺伝子セット濃縮 (GAGE) を実行しました 19。 合計 4 つの遺伝子セットは、代謝経路遺伝子セットが顕著に濃縮されており、有意なレベルの差異を示しました (図 3d)。 この代謝経路遺伝子セットにおける DE 遺伝子（Padj < 0.05）の分析により、男性と女性の BEC 間で合計 142 個の遺伝子が変化し、そのうち 43 個の遺伝子が FA 代謝に関連していることが示されました（拡張データ図 6b および補足データセット 1）。 しかし、BEC の代謝と血管新生における BEC の役割についての理解は限られています。

a、2、12、および65週齢のマウスのBECにおける性別によるクラスター化を示すRNA-seqデータのPCAプロット（n = 3）。 b、火山プロットは、2、12、および65週齢のマウスの雌と雄の骨EC間の有意なFDR補正（ボンフェローニ）P値（Padj < 0.01）DE遺伝子の数とlog2倍変化を示します。 DE 遺伝子は、各遺伝子を一般化線形モデルに当てはめ、その後 Wald 検定を使用して仮説検定を行うことによって取得されました。 c、2、12、および65週齢のマウスの雄と雌の骨EC間のDE遺伝子の重複を示すベン図。 d、RNA-seqデータにおけるDE遺伝子の経路解析のためのGAGEは、高齢の男性と女性のBECの間で異なる生物学的プロセスを示しています。 代謝経路、細胞周期、DNA の遺伝子データセットは上方制御され、原発性免疫不全経路遺伝子は下方制御されます。 濃縮の有意性は 2 サンプル t 検定を使用して計算され、有意な KEGG 項は P < 0.05 を使用して選択されました。 e、グルコース、グルタミンまたはFAを添加した無栄養培地でビヒクルを使用したKi-67+培養BECの定量を示すグラフ（対照n = 9、グルコース n = 11、グルタミン n = 15、FA n = 12）および E2 処理 (コントロール n = 11、グルコース n = 11、グルタミン n = 13、FAs n = 12)。 データは平均値±標準偏差です。 Tukey 検定を使用した二元配置分散分析。 f、エトモキシル処理の有無にかかわらず、ビヒクルまたはE2で処理されたKi-67+培養BECの定量を示すグラフ（n = 5）。 データは平均値±標準偏差です。 Tukey 検定を使用した二元配置分散分析。 g、ビヒクル処置およびエトモキシル処置マウスにおけるH型(Emcnhigh/CD31high)血管の代表的な共焦点画像。 骨幹端の面積 (mp) に対して正規化された H 型 EC の定量化 (n = 5)。 データは平均値±標準偏差です。 対応のない両側 t 検定。 フローサイトメトリーによって定量化された総EC (CD31+CD45−Ter119−) (n = 5)。 データは平均値±標準誤差です。 対応のない両側 t 検定。 スケールバー、50μm。 PC、主コンポーネント。

ソースデータ

BEC の基礎代謝制御を理解するために、他のシステムで血管新生を制御することが知られている主要な代謝経路をテストしました 20、21、22。 私たちは、FA（無血清）、グルコース、グルタミンの非存在下で培養BECをサポートできる栄養補助食品を調べました。 我々は、一次BECにFAを補給しても、グルコースやグルタミンはBECを維持しないことをin vitroで発見した（図3e）。 この結果により、BEC における FA 代謝をさらに調査し、阻害するようになりました。 CPT1A、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ 1a は、FA をミトコンドリアに輸送することによる FA 酸化の律速酵素です。 CPT1A阻害剤エトモキシルで処理すると、培養BECの増殖が減少しました（図3f）。 同様に、生後10日目（P10）マウスにエトモキシルを10日間投与すると、骨内の血管の成長が減少しました（図3g）。 FA代謝の骨内皮特異的役割を調査するために、EC特異的Cdh5(PAC)CreERT2と交配したCpt1a floxedマウス21を使用して、EC内のCPT1Aを遺伝的に標的とした。 BECにおけるCPT1A機能の喪失は、放射性標識された3H-パルミチン酸の酸化の減少を示し、FA代謝の障害を示しました（図4a）。 血管の分析により、同腹子対照と比較してCpt1aiΔEC骨の総ECおよびH型ECの減少が示され、欠陥のある血管成長が示されました（図4a）。 さらに、Cpt1aiΔEC 変異体の骨では、OBL 細胞の減少と脂肪細胞の増加が示されました。 変異骨のマイクロCT分析により、骨と脂質の含有量の変化が確認され（拡張データ図6c）、BMの調節における内皮FA代謝の重要性が示唆されました。

a、コントロールおよびCpt1a欠失BECによる3H標識パルミテートの酸化を示すグラフ。 グラフは、コントロール骨およびCpt1a iΔEC 変異骨からの精製BECにおけるCpt1a mRNAレベルを示しています。 H 型血管容積の定量化を伴う、コントロールおよび内皮 Cpt1a 欠失変異体における H 型 (Emcnhigh/CD31high) 血管の代表的な共焦点画像 (コントロール n = 6 F、n = 8 M; 変異体 n = 6 F、n = 5M）およびフローサイトメトリーによって特徴付けられた総EC（CD31+CD45−Ter119−）（コントロールn = 6F、n = 5M;変異体n = 10F、n = 5M）。 データは、画像定量化 (H 型ボリューム) の平均 ± 標準誤差、および 3H-パルミチン酸、フローサイトメトリーおよび qPCR データの平均 ± 標準誤差です。 3H パルミチン酸データ (対応のない両側 t 検定) を除いて、テューキー検定を使用した二元配置分散分析を実行しました。 スケールバー、40μm。 b、ビヒクル処理およびE2-におけるグルコース（ビヒクルn = 6、E2 n = 5）、グルタミン（ビヒクルn = 5、E2 n = 5）およびパルミチン酸（ビヒクルn = 6、E2 n = 6）の酸化を示すグラフ。処理された BEC、放射能 (1 分あたりの崩壊 (dpm)) によって測定されました。 データは平均値±標準誤差です。 対応のない両側 t 検定。 c、エトモキシル処理の有無にかかわらず、ビヒクルまたはE2で処理したBECによるパルミチン酸酸化を示すグラフ（n = 5）。 データは平均値±標準誤差です。 Tukey 検定を使用した二元配置分散分析。 d、E2で処理した対照およびCpt1aiΔEC変異体マウスにおけるH型(Emcnhigh/CD31high)血管を示す代表的な共焦点画像。 スケールバー、50μm。 定量化により、mp の面積に正規化された H 型 EC (コントロール n = 5 F、n = 5 M、変異体 n = 5 F、n = 5 M) およびフローサイトメトリーで定量された総 EC (CD31+CD45−Ter119−) が示されます。 (コントロール n = 5 F、n = 5 M; 変異体 n = 5 F、n = 5 M)。 データは、画像定量化の場合は平均 ± SD、フローサイトメトリー データの場合は平均 ± SEM です。 Tukey 検定を使用した二元配置分散分析。 F、女性。 M、男性。 MP、骨幹端。

ソースデータ

次に、原発性BECをE2で処理することにより、エストロゲンが内皮代謝にどのような影響を与えるかを調査しました。 E2は、栄養素枯渇条件におけるBECのFA依存性を変化させませんでした（図3e）。 さらに、14C-グルコースまたは14C-グルタミンの変化しない酸化と比較して3H-パルミチン酸の酸化の増加は、E2処理がFAの使用を促進することを示唆しました（図4b）。 注目すべきことに、エトモキシルはE2媒介細胞増殖(図3f)およびFA酸化(図4c)を阻害した。 in vivo の関係を理解するために、Cpt1aiΔEC 変異マウスに E2 を投与して血管新生を調べました。 E2の投与では、Cpt1aiΔEC変異体骨で阻害された血管新生は回復せず、E2媒介血管成長の下流FA依存性が裏付けられました（図4d）が、E2は間葉区画のOBL細胞を増加させ、脂肪細胞を減少させました（拡張データ図6d）。 。 まとめると、データは、エストロゲンが骨の血管新生を促進するために FA を必要とすることを示しました。

骨髄脂肪細胞は、造血細胞のエネルギー源として遊離 FA を放出することが示唆されています 23。 我々は、BECがFAの取り込み、輸送、代謝に関与する膜脂質輸送体である脂肪酸結合タンパク質4（FABP4）を発現していることを確認しました（図5a）。 E2処理した骨は、血管内でFABP4発現の上方制御を示し(図5bおよび拡張データ図7a)、これによりBECにおける脂質輸送を調査することになった。 BEC における FA の取り込みを分析するために、培地中に BODIPY 結合合成 FA の 30 分間の短いパルスを提供しました。 対照と比較して、E2処理BECにおける高いBODIPYレベルの検出は、E2によるFA取り込みの促進を示した（図5cおよび拡張データ図7b）。 また、LipidTOX を使用して E2 処理後の BEC の FA レベルもチェックしました。 高い細胞内脂質レベルを有するより多くのBECが検出されたことは、E2処理時の脂質取り込みを裏付けた(拡張データ図7c)。 FA取り込みにおけるFABP4の機能的役割を理解するために、E2の存在下および非存在下でBECを薬理学的FABP4阻害剤BMS-309403で処理しました。 BMS-309403で処理したBECにおけるBODIPYレベルの低下（図5c）は、E2媒介FA取り込みにおけるFABP4の関与を示した。 さらに、GPER1 の薬理学的アンタゴニストである ER シグナル伝達阻害剤 G36 の存在下での脂質の取り込みを調査しました。 G36で処理したBECにおけるBODIPY取り込みの障害により、ERシグナル伝達の下流機構として脂質輸送が確認された（拡張データ図7d）。 さらに、Esr1iΔECおよびGper1iΔEC変異マウスの血管におけるFABP4発現の減少（拡張データ図7e）は、FA取り込み欠陥と血管新生の減少との関連を示した。

a、共焦点画像の最大強度投影。骨 EC における FABP4 (緑色) 発現と Emcn (赤色) 発現の重複を示します。 スケールバー、50μm。 b、グラフは、共焦点顕微鏡を使用して画像化された、ビヒクル処理およびE2処理された処理骨（n = 5）の骨組織切片で観察されたFABP4タンパク質レベルの定量化を示しています。 データは平均値±標準偏差です。 Tukey 検定を使用した二元配置分散分析。 転写レベルは、qPCR を使用して、ビヒクル投与マウスおよび E2 投与マウス (n = 5) の単離された骨 EC から定量されました。 データは平均値±標準誤差です。 Tukey 検定を使用した二元配置分散分析。 c、FABP4阻害剤BMS-309403処理時のビヒクル処理およびE2処理BECにおけるBODIPY結合合成FAの脂質取り込みの代表的な共焦点画像。 スケールバー、15μm。 定量化により、複数×63 視野にわたって FABP4 阻害による内皮 BODIPY の蛍光単位 (FU、強度) の減少が示されました (ビヒクル n = 37; ビヒクル + BMS-309403 n = 36; E2 n = 41; E2 + BMS-309403 n = 42）。 データは平均値±標準偏差です。 Tukey 検定を使用した二元配置分散分析。 d、若い骨と老化した骨からのBM脂肪細胞（ペリリピン+、緑色）の代表的な共焦点画像。 スケールバー、50μm。 グラフは、ペリリピン + 脂肪細胞の平均数 (n = 17)、サイズ (n = 15)、および蛍光強度の定量化を示しており、若いマウス (n = 84 F、52 M) と比較して、高齢マウス (n = 84 F、52 M) では脂肪分解酵素 ATGL が減少していることを示しています。複数の ×20 視野にわたってセルあたり 50 F、58 M)。 データは平均値±標準偏差です。 Tukey 検定を使用した二元配置分散分析。 e、BM脂肪細胞（ペリリピン+）の代表的な共焦点画像。蛍光強度の定量化により、P28マウス（HSL n = 78 F、88 M）と比較した高齢マウス（HSL n = 120 F、168 M）の脂肪分解酵素HSLの減少が示されています。 ) 複数の×20 視野にわたるセルごと。 データは平均値±標準偏差です。 Tukey 検定を使用した二元配置分散分析。 スケールバー、50μm。 F、女性。 M、男性。 プリン、ペリリピン。

ソースデータ

Esr1iΔEC および Gper1iΔEC 変異骨の BEC における FA の取り込みと血管形成の欠陥は、微小環境における脂肪細胞の蓄積と関連していました。 加齢に伴う血管新生および骨形成の低下6、7、9、24、25には、脂肪細胞の同時増加が関与していました26、27。 老化した骨の血管新生状態の低下は、BM 内の脂肪細胞の数とサイズの増加に関連しています。 反対に、血管新生の高い若い骨は、脂肪細胞が小さくて少ないことを示し、血管新生ECと脂肪細胞の間に逆相関があることを示しました（図5d、e）。 若い骨に存在する小さな脂肪細胞は、老化した骨に存在する大きな脂肪細胞と比較して、脂肪分解酵素である脂肪トリグリセリドリパーゼ（ATGL）およびホルモン感受性リパーゼ（HSL）の高い発現を示しました。 したがって、若い血管新生骨に存在する限られた脂肪細胞は、高レベルの脂肪分解酵素を示した。 同様に、血管新生が減少した老化した骨では、脂肪細胞内の脂肪分解性リパーゼのレベルが低くなっています（図5d、e）。

脂肪細胞は ER を発現し、循環エストロゲンレベルに応答することが以前に示されています 28,29。 しかし、内皮変異体における脂肪細胞数の変動（Esr1iΔEC、Gper1iΔEC、およびCpt1aiΔECマウスの脂肪細胞表現型を参照）により、これらの変異体における脂肪分解酵素の発現を調査するようになりました。 Cpt1aiΔECおよびGper1iΔEC変異体の骨に存在する脂肪細胞は、低レベルの脂肪分解性リパーゼを示しました（拡張データ図8a）。 データは、BM 内の脂肪細胞の脂肪分解の調節に BEC が関与していることを示しました。 脂肪細胞に作用する潜在的な EC 由来のシグナルを特定するために、単離された BEC の脂肪分解因子の発現を分析しました。 E2 投与マウスから精製した BEC は、よく知られているパラクリン脂肪分解因子である Tnfa および Il6 の上方制御を示しました。 Esr1iΔECおよびGper1iΔEC変異体BECにおけるERシグナル伝達の障害は、内皮TnfaおよびIl6レベルの下方制御を示した(拡張データ図8b)。 これらの脂肪分解因子の発現の低下は、これらの変異骨における脂肪細胞の蓄積をサポートしました。 同様に、インビトロ培養BECのE2処理は、対照処理と比較して培地中に高レベルのTNF-αおよびIL-6を放出し（拡張データ図8c）、BECからのアンジオクリン放出が確認されました。 血管新生の減少、つまり BEC での脂質使用の減少は、BM での脂肪分解と脂肪細胞の蓄積の減少に関連しています。 これらのデータは、BMにおける血管新生と脂肪分解の間の代謝相互作用を示唆しています。

骨格の老化は、骨量の減少に寄与する血管の変化と関連しています9,24,25。 加齢に伴うエストロゲンレベルの低下30、31、32、33は、女性の重度の骨量減少を引き起こしました。 エストロゲンの投与は、加齢に伴う骨損失を防ぐことが示されています 34,35,36,37。 高齢マウスに E2 を投与すると、総 EC、H 型毛細血管、OBL 細胞が促進され、脂肪細胞が減少しました (拡張データ図 9a)。 また、E2を投与したマウスの骨における細動脈および経皮質血管の増加にも注目しました（拡張データ図9b）。 加齢に伴う細胞活性酸素種（ROS）の増加38は広く認識されています。 注目すべきことに、高齢のマウスにE2を投与すると、血管の内皮ROSレベルが有意に減少しました（図6a）。 さらなる分析により、4-ヒドロキシノネナール39 (HNE) レベルと LPO センサーである BODIPY 665/676 を使用して証明されたように、老化した BEC における LPO の蓄積が示されました。 E2を投与したマウスのBECではLPOレベルが低下していることがわかりました（図6b、cおよび拡張データ図9c）。 同様に、閉経によって誘発された骨の内皮HNEの増加は、エストロゲン枯渇状態における高い脂質過酸化を裏付けています（拡張データ図9d）。

a、ビヒクル処理マウス(n = 8 F、n = 8 M)およびE2処理マウス(n = 7 F、n = 7 M)のECにおけるROS生成の代表的なフローサイトメトリープロット。 ヒストグラム プロットの赤いピークは、染色されていない細胞を示します。 定量化により、E2 処理による ROS の減少が示されています。 データは平均値±標準誤差です。 Tukey 検定を使用した二元配置分散分析。 b、若いビヒクル処理マウス（n = 5 F、n = 5 M）およびE2処理マウス（n = 5 F、n = 5 M）、および高齢のビヒクル処理マウスにおける免疫染色からのEC内の4-HNEレベルの定量化マウス (n = 5 F、n = 5 M) および E2 処理マウス (n = 5 F、n = 5 M)。E2 処理により 4-HNE レベルの低下が示されました。 データは平均値±標準偏差です。 Tukey 検定を使用した二元配置分散分析。 c、若いビヒクル処理マウス（n = 5 F、n = 5 M）およびE2処理マウス（n = 5 F、n = 5 M）、および高齢のビヒクル処理マウスのECにおけるLPO生成の代表的なフローサイトメトリープロット(n = 6 F、n = 5 M) および E2 処理マウス (n = 5 F、n = 5 M)。 ヒストグラム プロットの赤いピークは、染色されていない細胞を示します。 定量化により、E2 処理による LPO の減少が示されています。 データは平均値±標準誤差です。 Tukey 検定を使用した二元配置分散分析。 d、ビヒクル処理マウスおよびE2処理マウスのBECにおける細胞内第一鉄イオン濃度の性差を示すグラフ（n = 4）。 データは平均値±標準誤差です。 Tukey 検定を使用した二元配置分散分析。 e、P10マウス（n = 6 F、n = 8 M）および高齢マウス（n = 6 F、n = 4 M）のBECにおける細胞内第一鉄イオンの性差を示す定量化付きの代表的なフローサイトメトリープロット。 データは平均値±標準誤差です。 対応のない両側 t 検定。 f、高齢マウスにおけるLip-1治療によるH型EC（CD31high/Emcnhigh）の増加を示す定量化を含む代表的なフローサイトメトリープロット（ビヒクルn = 6 F、n = 5 M; Lip-1 n = 5 F、n = 5メートル）。 データは平均値±標準誤差です。 Tukey 検定を使用した二元配置分散分析。 g、ビヒクル処理マウスおよびLip-1処理マウスの高齢のBEC集団の代表的なフローサイトメトリープロット。 定量は脂質 ROS を含む EC のものであり (ビヒクル n = 6 F、n = 4 M、Lip-1 n = 4 F、n = 4 M)、Lip-1 処理による減少を示しています。 ヒストグラム プロットの赤いピークは、染色されていない細胞を示します。 データは平均値±標準誤差です。 Tukey 検定を使用した二元配置分散分析。 F、女性。 M、男性。

ソースデータ

FABP4 は、細胞の ROS40 を減少させることにより、酸化ストレスに対する保護に寄与することが示されています。 注目すべきことに、E2投与は老化した骨内皮におけるFABP4発現を改善し、BECにおけるFABP4とLPOとの間の潜在的な関係を示した(拡張データ図10a)。 BECにおけるFABP4の阻害はHNEの蓄積を示し、LPO生成へのHNEの関与を示唆した(拡張データ図10b)。 E2補給はFABP4媒介HNE蓄積を減少させることができず、これはE2機能のFABP4依存性を示している(拡張データ図10b)。 さらに、このデータは、過酸化物の生成をもたらす複数の細胞機構の調節における E2 の機能を調査することを主張しました。

細胞の Fe2+ レベルは、フェロトーシス依存性のメカニズムを通じて細胞内での LPO の生成に寄与します 41,42。 加齢に伴う内皮 LPO レベルの増加における Fe2+ の寄与を理解するために、男性と女性の両方の BEC における Fe2+ 濃度を調査しました。 細胞内の不安定なFe2+濃度は、雌と比較して精製雄BECで高く、若いBECではE2処理によって変化しませんでした（図6d）。 次に、FeRhoNox-1 標識を使用して、BEC 内の Fe2+ レベルを検出および定量しました。 FeRhoNox-1 標識では、女性と比較して若い男性の BEC で高い Fe2+ レベルも検出されました。 興味深いことに、老化した骨の定量化により、男性と比較して高齢の女性のFe 2 + BECのパーセンテージが高いことが示されました（図6e）。 鉄キレート剤であるメシル酸デフェロキサミン (DFM) を含む初代 BEC の培養により、内皮 LPO レベルが減少しました。 同様に、アルテミシニンを使用した Fe2+ 媒介過酸化物生成の誘導は、内皮 LPO レベルを増加させました。 E2処理は、インビトロでDFM処理BECおよびアルテミシニン処理BECの両方においてLPOレベルを低下させた(拡張データ図10c)。 DFM は、高齢マウスの H 型血管と骨形成を促進することが示されています9。 我々は、DFMを投与されたマウスのBECにおけるLPOレベルの低下を発見した(拡張データ図10d)。 同様に、若いマウスにおけるアルテミシニン（200 mg kg-1）の治療は、脂肪細胞に変化を伴わずに、H型毛細血管とOBL細胞の減少をもたらしました（拡張データ図10e）。 これらのデータは、内皮 LPO 産生における Fe2+ の役割、したがって骨内の血管の老化表現型を示唆しました。

高齢の女性 EC における高い基礎 Fe2+ レベルは、閉経期などのエストロゲン枯渇状態における LPO の産生と H 型および骨の損失を悪化させる可能性があります。 E2によるLPO産生の減少（図6b、c）は、閉経後の骨量減少に対するホルモン補充療法（HRT）の臨床的利点の根底にある潜在的なメカニズムを示唆しました。 これをテストするために、我々は、過酸化脂質阻害剤であるリプロクススタチン-1 (Lip-1) を使用して、高齢のマウスで LPO 産生を薬理学的に標的にしました。 ビヒクル対照で処理した高齢マウスは、Lip-1（10 mg kg-1）を投与したマウスと比較してH型血管をほとんど含まず、血管新生毛細血管の増加を示しました（図6f）。 BECのROSレベルの分析により、Lip-1処理骨の減少が実証されました（図6g）。 さらに、Lip-1を介したH型毛細血管の増加は、老化した骨におけるOBL細胞の増加および脂肪細胞の減少と関連しています（図7a）。 老化した骨のマイクロCT分析により、Lip-1処置マウスの骨で観察された増加と脂質含量の減少が確認された（図7bおよび拡張データ図10f）。

a、Lip-1で治療した高齢マウスのBMの代表的な共焦点画像。グラフはmpフィールドあたりのH型血管容積の定量化を示しています（ビヒクルn = 5 F、n = 5 M; Lip-1 n = 5 F、 n = 5 M)、mp 1 mm あたりのオステリックス + 細胞数 (ビヒクル n = 5 F、n = 5 M; Lip-1 n = 5 F、n = 5 M)、および mm 面積あたりのペリリピン + 面積 (ビヒクル n = 5 F、 n = 5 M、Lip-1 n = 5 F、n = 5 M）。 データは平均値±標準偏差です。 Tukey 検定を使用した二元配置分散分析。 スケール バー、40 μm (ビヒクル) および 50 μm (Lip-1)。 b、Lip-1で治療した高齢マウスの骨の代表的なマイクロCT画像。骨梁の体積、数、厚さ、間隔（n = 4）および脂肪細胞の体積（n = 4）の定量化を示すグラフ。 データは平均値±標準誤差です。 Tukey 検定を使用した二元配置分散分析。 F、女性。 M、男性。 Osx、オステリックス。 プリン、ペリリピン。

ソースデータ

この研究では、エストロゲンがBECのFA代謝を促進することにより血管成長の媒介に重要な役割を果たしていることを発見しました（図8）。 遺伝的ER機能喪失研究は、男性と女性の両方のBECの骨血管系における構成エストロゲンシグナル伝達を示しており、下流シグナル伝達の媒介におけるそれらの用量依存性、相互作用、および冗長性を調査することが強く主張されています。

エストロゲンは、内皮 ESR1 および GPER1 を通じて骨内の血管の成長を調節します。 ERシグナル伝達は、脂肪分解因子、酵素のアンジオクリン放出、および微小環境からのFAの取り込みを促進することにより、ECによるFA代謝の利用を調節します。 老化した内皮における脂質代謝の障害と内皮の第一鉄イオンレベルの性差は、骨の血管における老化表現型を刺激します。

活発に成長する骨における血管新生は、脂肪細胞数の制限と関連しており、加齢に伴う血管新生の低下は、骨内の脂肪細胞の蓄積と関連しています。 女性では、エストロゲン治療により脂肪分解が引き起こされ、骨髄脂質含有量が減少することが確認されています43。 骨脂肪細胞の調節におけるエストロゲンの役割は広く認識されています。 ここでは、これまで知られていなかった血管と脂肪細胞の関連性を示します。 われわれは、BECにおける脂質代謝の阻害がBMにおける脂肪細胞の増加につながることを発見した。 閉経期の動物モデルでは、人間の老化と同様に、血管新生の減少は脂肪細胞の蓄積と関連しています。 私たちのデータは、エストロゲンが血管の成長のための脂肪分解を促進することによって代謝結合を調節し、BMのエネルギーバランスを維持する可能性があることを示唆しています。

血管老化の組織特異的な性質 44 は、まだ理解の初期段階にあります。 われわれは、固有の第一鉄イオンレベルが BEC の老化を促進し、男性と比較して高齢の女性で観察される骨量減少に寄与する可能性があることを発見しました。 リポキシゲナーゼの鉄依存性、非ヘム性は、内皮 LPO レベルにおける鉄の重要性を裏付けています。 全体として、エストロゲンは、BEC における LPO の蓄積を制限する重要な要素です。 エストロゲンの減少、第一鉄イオン、LPO の複合的な影響により、女性の老化が促進されます。 この研究は、加齢に伴う心血管疾患の発生率に観察される性別による偏りを理解するために、血管系の性差を調査するという基本的な概念を裏付けるものである。 この研究の結果は、LPO がエストロゲンの下流標的であることを特定し、LPO を標的とすることが閉経後の骨量減少と骨修復を治療するための HRT に代わる戦略となる可能性があることを示唆しています。 さらに、骨内皮の性差に関する基本的な知識は、血液や骨の疾患に対する精密医療の開発に役立ちます。

すべての動物実験は、インペリアル・カレッジ・ロンドン動物福祉倫理審査機関および英国内務省によって承認されたプロトコールに従って、施設のガイドラインおよび法律に従って実施されました。 すべての野生型実験は C57BL/6J マウスで行われ、年齢と性別が一致しました。 すべてのトランスジェニック マウスは、各実験で年齢と性別が一致しました。

妊娠実験では、妊娠の開始は膣栓の存在によって判定されました。 膣栓の同定後の該当日にマウスを、対照として処女の雌マウスと雄マウスとともに殺処分した。

ホルモン治療のために、エタノールおよびコーン油（１００μｌ）に溶解した２μｇの１７β－エストラジオール（Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ）、１ｍｇのプロゲステロン（Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ）、または１００μｇのＤＨＴ（ＴＣＩ）をマウスに皮下（ｓ．ｃ．）注射した。 ビヒクルマウスには、等量のコーン油中のエタノールを投与した。 子犬（P10）には断続的に10回の注射を行い、高齢マウス（65〜75週）には週に3回の注射を6週間受けました。 17β-エストラジオールを注射したマウスに、増殖中のECを同定するために殺処分する3時間前にEdU (250 mg ml-1)を腹腔内(ip)注射した。 子犬（Ｐ１０）には、抗アロマターゼ治療のためにＤＭＳＯ中のレトロゾール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）１０μｇを１０回投与した。

マウス閉経モデルでは、雌マウスに 160 mg kg-1 day-1 の 4-ビニルシクロヘキセン ジエポキシド (Fluorochem) を 20 日間注射し、さらに 32 日間放置して完全な卵胞閉鎖を誘導しました。 継続的な発情期を確認するために毎日膣サンプルを採取しました。 対照マウスにはＰＢＳを注射した。

OVX マウスは Charles River Laboratories UK から購入しました。 C57BL/6J野生型マウスに対して卵巣切除術を実施した。 E2コホートには手術の2週間後に17β-エストラジオールを4週間投与した(週に3回注射)のに対し、対照コホートにはビヒクル注射を行った。

ＤＦＭをマウスの体重２５μｇｇ−１で腹腔内投与し、２週間隔日ごとに投与した。 最後の注射の翌日にマウスを分析のために屠殺した。 CPT1Aを阻害するために、30 mg kg-1のエトモキシルを10日間腹腔内注射し、P28にマウスを屠殺した。

ERの内皮特異的欠失のために、条件付きEsr1lox/lox、Esr2lox/loxまたはGper1lox/loxマウスをCdh5(PAC)-CreERT2トランスジェニックマウスと交配させた。 Cre 活性は、P10 ～ P14 マウスからのタモキシフェン (80 mg kg-1) 注射によって誘導され、マウスは P28 で分析されました。 同腹子 Cre マウスにもタモキシフェンを注射し、対照として使用しました。 同様に、条件付きCpt1alox/loxマウスを、内皮特異的欠失を目的としたCdh5(PAC)-CreERT2トランスジェニックマウスと交配し、マウスをP28で分析した。 成体段階で Cre 活性を誘導するために、マウスに P66 から P70 まで注射し、P84 で殺処分しました。

若いマウスにおいてＬＰＯの生成を誘導するために、子マウス（Ｐ１０）に、ＤＭＳＯ中のアルテミシニン（ＴＣＩ、２００ｍｇ ｋｇ−１）の断続的な腹腔内注射を５回与えた。 高齢マウスにＬＰＯ産生を阻害するために、Ｌｉｐ－１（Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、１０ｍｇ ｋｇ －１ ）を腹腔内に４週間１５回投与した。

脛骨を解剖して洗浄し、4％パラホルムアルデヒド（PFA）溶液中で氷上で4時間直ちに固定し、続いて4℃で一定に撹拌しながら0.5M EDTAで脱灰した。 次いで、骨を凍結保存溶液（２０％（ｗ／ｖ）スクロースおよび２％（ｗ／ｖ）ポリビニルピロリジン（ＰＶＰ））中にさらに４８時間保存した。 凍結切片の場合、骨を 8% (w/v) ゼラチン、20% (w/v) スクロース、および 2% (w/v) PVP に包埋しました。 Leica クライオスタットを使用して、免疫染色に使用される顕微鏡スライド上に 70 μm 切片を作成しました。

免疫組織化学による脛骨の表現型分析では、骨切片を PBS で水和し、その後 0.25% Triton X-100 で 10 分間透過処理し、5% ロバ血清 (DS) で 30 分間ブロッキングしました。 一次抗体を 5% DS で希釈し、室温で 2.5 時間、または 4 °C で一晩インキュベートしました。 使用した一次抗体には、抗エンドムチン (Santa Cruz Biotechnology、1:100)、抗オステリックス (Abcam、1:600)、抗 CD31 (R&D Systems、1:100)、抗ペリリピン (Cell Signaling Technology、1: 100)、抗ペリリピン (GeneTex、1:100)、抗 Ki-67 (Abcam、1:100)、抗ラミニン (Sigma-Aldrich、1:100)、抗 FABP4 (R&D Systems、1:100) )、抗 4-ヒドロキシノネナール (Abcam、1:200)、抗 HSL (Cell Signaling Technology、1:50)、抗 ATGL (Cell Signaling Technology、1:100)、抗 CD45 (BD Pharmingen、1: 100) および反 Itgb3 (セル シグナリング テクノロジー、1:100)。

次いで、スライドをＰＢＳで各５分間３回洗浄し、５％ＤＳで希釈した蛍光団結合二次抗体とともに室温で１時間インキュベートした。 使用した二次抗体には、抗ラット Alexa Fluor 594 (Invitrogen、A21209、1:400)、抗ラット Alexa Fluor 488 (Invitrogen、A21208、1:400)、抗ヤギ Alexa Fluor 488 (Invitrogen、A11055、1:400) が含まれます。 )、抗ヤギ Alexa Fluor 546 (Invitrogen、A11056、1:400)、抗ヤギ Alexa Fluor 647 (Invitrogen、A21447; 1:400)、抗ウサギ Alexa Fluor 488 (Invitrogen、A21206、1:400)、抗ウサギ Alexa Fluor 546 (Invitrogen、A10040、1:400) および核染色用の DAPI。 スライドをＰＢＳで３回、それぞれ１０分間洗浄し、次いで、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ Ｇ溶液（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用してカバースリップでマウントした。

EdU標識は、一次抗体および二次抗体のインキュベーション後、メーカーのガイドラインに従ってClick-iT化学（Invitrogen、C10340）によって実行されました。

高解像度の三次元 (3D) 画像は、Leica LASX ソフトウェアを使用する Leica TCS SP8 共焦点レーザー走査顕微鏡を使用して取得されました。

マイクロCTを使用した表現型分析のために、突然変異体とその同腹子対照、または対照マウスと治療マウスから新鮮な脛骨と大腿骨を収集しました。 新たに分離した骨を徹底的に洗浄し、4% PFA で固定しました。 骨の石灰化領域を分析するために、固定された骨をマイクロ CT スキャンに使用しました。 脂質分析のために、四酸化オスミウム標識を実施しました。 簡単に説明すると、固定した骨を EDTA 溶液で 3 ～ 10 日間脱灰し、2% 四酸化オスミウム溶液で 48 時間染色しました。 その後、骨を徹底的に洗浄し、分析まで保管しました。 骨は、キャビネットコーンビームマイクロCT(μCT 100、Scanco Medical)およびScanco MedicalのIPLソフトウェアバージョン5.15を使用してスキャンされた。 3 つの空間次元すべてで 10 μm のボクセル サイズが選択されました。 各サンプルについて、電圧 70 kVp、強度 114 μA、8 W、積分時間 800 ms で 4 mm 以上をカバーする少なくとも 400 のスライスが評価されました。 評価のために、成長板の下の長さ 3 mm が対象の体積として選択されました。

脛骨および大腿骨を解剖し、氷冷ＰＢＳ中に収集し、続いて無菌条件下で無菌ＰＢＳで洗浄した。 骨を乳鉢と乳棒で粉砕し、残った骨の破片をコラゲナーゼで37℃で20分間消化し、一緒に濾過して単細胞懸濁液を得ました。 赤血球 (RBC) 溶解 (ChemCruz) を実行して (5 分間、室温) RBC を除去し、その後全細胞をペレットにして氷上に保管しました。

BECは、Dynabeadsヒツジ抗ラットIgG(Invitrogen)を製造業者のプロトコールに従って使用して単離した。 簡単に説明すると、まずビーズをラットエンドムチン (Santa Cruz Biotechnology) で 4 °C のローテーター上で 45 分間コーティングし、磁気ラック上で分離バッファー (0.1% FBS-PBS) で洗浄し、その後全細胞とともに 30 分間インキュベートしました。 EC のみを分離するために 4 °C のローテーター上で。 混合物を磁気ラック上の分離緩衝液で洗浄して、エンドムチン発現細胞の陽性選択を単離し、EGM-2増殖を補充したEBM-2基礎培地(Lonza)中のフィブロネクチンでコーティングした(Sigma-Aldrich)細胞培養プレートにプレーティングした。培地(2% FBS、0.4% hFGF-B、0.1% VEGF、0.1% R3-IGF-1、0.1% アスコルビン酸、0.1% hEGF、0.1% ヘパリンおよび 0.04% ヒドロコルチゾン)。 0.25% トリプシン-EDTA (Sigma-Aldrich) を使用して細胞を 3 ～ 4 日ごとに継代しました。

EGM2完全培地で1日間増殖させたBECをこの実験に使用しました。 HBSSで洗浄した後、細胞をビヒクル（DMSO）または17β-エストラジオール（10μM）のいずれかで、グルコース、グルタミン、血清を含まないEC培地（Cell Biologics）中で16時間処理し、5 mMグルコースを補充しました。 、2 mM グルタミンまたは 20 mM リノール酸 - オレイン酸 (Sigma-Aldrich) を使用して、細胞増殖に対する栄養素補給の効果を測定します。 細胞を抗 Ki-67 抗体 (Abcam、1:300) で染色して EC 増殖を測定するか、抗切断カスパーゼ-3 抗体 (Cell Signaling Technology、1:300) で染色してアポトーシスを測定しました。

カバースリップ上で培養した BEC をビヒクル (DMSO) または 17β-エストラジオールで 60 時間処理し、その後 BODIPY 558/568 C12 (Thermo Fisher Scientific、1 μM) とともにインキュベートするか、HCS LipidTOX Green (Thermo Fisher Scientific、1:1,000) で染色しました。 ) 37 °C で 30 分間。 細胞を洗浄し、スライドに載せ、Leica TCS SP8 共焦点顕微鏡を使用して画像化しました。

カバースリップ上で培養したBECを、エトモキシル(100μM)とともにビヒクル(DMSO)または17β-エストラジオールで処理した。 細胞を抗 Ki-67 抗体 (Abcam、1:300) で染色して EC 増殖を測定するか、抗切断カスパーゼ-3 抗体 (Cell Signaling Technology、1:300) で染色してアポトーシスを測定しました。

カバースリップ上で培養したBECを、BMS-309403 (10μM)とともにビヒクル(DMSO)または17β-エストラジオールで処理した。 細胞を BODIPY 558/568 C12 で染色して、脂質の取り込みが減少したかどうかを確認しました。

カバースリップ上で培養したBECをビヒクル（DMSO）またはG36（Tocris Bioscience、10μM）とともに17β-エストラジオールで60時間処理し、脂質取り込みについて説明したようにBODIPY 558/568 C12で染色しました。

BEC は男性と女性の骨から別々に培養され、アッセイ前にビヒクル (DMSO) または 17β-エストラジオールで 60 時間処理されました。 BEC をトリプシン処理および遠心分離によって収集し、超音波処理によって溶解し、鉄アッセイ緩​​衝液 (Abcam、ab8366) に再懸濁しました。アッセイは、593 nm で測定した吸光度 (OD) および鉄による鉄 (II) アッセイの製造元ガイドラインに従って実施しました。 (II) 標準曲線によって決定される含量。

第一鉄イオン酸化還元反応によって生成された LPO は、メーカーのプロトコルに従って比色分析 (Cayman Chemical、705003) によって測定されました。 簡単に言うと、Dynabeads を使用して、以前に説明したようにビヒクルまたは E2 で処理した若いマウスと高齢のマウスの骨から全 EC を単離し、ビーズ除去時に超音波処理によって溶解しました。 メタノール:クロロホルム抽出に続いて、クロロホルム層をチオシアン酸イオンと反応させ、FLUOstar Omega Microplate Reader 3.0を使用して500 nmでODを測定することによって生成されたLPOを検出しました。

17β-エストラジオールの濃度は、製造業者のプロトコールに従ってELISA(Abcam、ab108667)により血清から測定した。 循環血液をマウスから採取し、室温で 45 ～ 60 分間凝固させ、3,500 rpm で 10 分間遠心分離して血清を得ました。 17β-エストラジオール-HRP コンジュゲートをサンプルまたは標準に添加し、37 °C で 2 時間インキュベートしました。 すべてのサンプルを洗浄した後、TMB 基質を添加し、室温でさらに 30 分間インキュベートしました。 反応は停止液の添加によって停止され、OD が 450 nm で測定され、標準曲線を使用して E2 濃度が定量されました。

媒体（DMSO）または17β-エストラジオールで処理した培養BECから上清を収集し、メーカーのプロトコールに従ってELISAを使用して放出されたTNFα（R&D Systems、MTA00B）およびIL-6（R&D Systems、M6000B）の濃度を測定しました。 具体的には、アッセイ希釈剤を標準またはサンプルに添加し、室温で 2 時間インキュベートしました。 すべてのサンプルを洗浄した後、それぞれのタンパク質複合体を 2 時間添加し、その後さらに洗浄し、基質溶液とともに 30 分間インキュベートしました。 OD を 540 nm および 450 nm で測定し (波長補正のために差し引いた)、タンパク質濃度を標準曲線によって決定しました。

大腿骨を切り出し、氷冷したＰＢＳ中で乳鉢と乳棒を用いて粉砕した。 骨髄溶液を 100 μm フィルターに通し、ペレット化しました。 上で説明したように、ＲＢＣ溶解（ＣｈｅｍＣｒｕｚ）を行った。 細胞を PBS に再懸濁し、全 EC について染色しました: 一次抗体 CD45 (BD Pharmingen、1:100) または H 型 EC: 一次抗体エンドムチン (Santa Cruz Biotechnology、1:50) および二次抗体 Brilliant Violet-421 (Jackson ImmunoResearch) 、１：５０）、ＣＤ３１－ＰＥ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、１：２０）またはＣＤ３１－ＡＰＣ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、１：２０）とともに。 抗体を MitoSOX (Thermo Fisher Scientific、1 μM) と 37 °C で 15 分間インキュベートした後、ミトコンドリア染色を実行しました。 BD FACSDiva 9.0.0 ソフトウェアを使用して、細胞を BD LSR II フローサイトメーターに通しました。

FABP4 染色では、一次抗 CD45 インキュベーション後に抗 CD31-PE とともに抗 FABP4-AF488 (Santa Cruz Biotechnology、1:50) を添加しました。

Ki-67 染色では、内皮全体について上で説明したように細胞を染色しました。 二次抗体染色と洗浄後、細胞を固定し、透過処理（0.1% BSA および 0.01% サポニン）し、室温で 45 分間 FITC 抗マウス Ki-67（BioLegend、1:75）で染色し、細胞を取得しました。 BD LSR II フローサイトメーター。

細胞内の第一鉄イオンを検出するために、総 EC の染色後、細胞を FeRhoNox-1 (Goryo Chemical、5 μM) とともに 37 °C で 15 分間インキュベートしました。

ビヒクル (DMSO) または 17β-エストラジオール (10 μM) で処理した培養中の BEC をトリプシン処理し、ペレット化し、BODIPY 558/568 C12 (Thermo Fisher Scientific、1 μM) または HCS LipidTOX Green (Thermo Fisher Scientific、1: 1,000) 取得前に 37 °C で 30 分間加熱します。

LPO センサーの場合、細胞は内皮全体について染色され、取得前に BODIPY 665/676 (Thermo Fisher Scientific、2 μg ml-1) とともに 37 °C で 30 分間インキュベートされました。

すべてのフローサイトメトリー分析は、FlowJo 10.0.0 ソフトウェアを使用して行われました。 全 EC は CD31+CD45-Ter119- 集団についてゲートされ、H 型 EC は Emcnhigh/CD31high 集団についてゲートされました。

すべての放射性同位体標識実験では、BEC をウェルあたり約 25,000 細胞で播種し、放射性標識の前にビヒクル (DMSO) または 17β-エストラジオールで 48 時間処理しました。 グルコースおよびグルタミンの酸化を測定するために、細胞を細胞培養培地中で 0.3 μCi/ml D-[6-14C]-グルコース (PerkinElmer) または 1.1 μCi/ml L-[14C(U)]-グルタミン (PerkinElmer) とともにインキュベートしました。 6時間。 細胞代謝を停止するために、室温で一晩、グルコースまたはグルタミンの酸化によって放出される 14CO2 を吸収するために、ヒアミン水酸化物に浸した濾紙を加えて、250 μl の過塩素酸を各ウェルに加えました。 放射能は液体シンチレーション計数によって測定し、1分あたりの崩壊を示した。 FA 酸化研究では、前述のようにエトモキシルを使用して CPT1A を阻害しました。 パルミチン酸酸化を測定するために、細胞を細胞培養培地中で 2 μCi/ml [9,10-3H]-パルミチン酸 (PerkinElmer) とともに 6 時間インキュベートしました。 細胞培養培地を濾紙を吊り下げたガラスバイアルに移し、37℃で48時間かけて放出された3H2Oを吸収しました。 放射能は液体シンチレーション計数（QuantaSmart）により測定し、1分あたりの崩壊を示した。

画像の Z スタックは 3D で再構成され、Imaris 画像分析ソフトウェア バージョン 9.0.0 を使用して分析されました。 ペリリピン + およびタイプ H 領域の定量化は、Z スタックの最大投影で ImageJ (フィジー) を使用して行われました。 Imaris を使用してバックグラウンドを除外するために osrerix+ 核の閾値直径を設定することにより、Osterix+ 細胞数をスポット検出機能を使用して自動的にカウントしました。 Type-H 血管容積は、Imaris で Emcn+CD31+ 容積の 3D オーバーラップを生成する表面機能を使用して定量化されました。 EdU+ EC は、表面機能を使用して Emcn+ 血管にマスクを適用した後、osterix+ 核と同様に、Imaris のスポット機能検出を使用して自動的にカウントされました。 Ki-67+ EC も同様に定量しました。 Emcn+ 4-HNE および FABP4 の平均蛍光強度 (MFI) は、体積分析用の Z スタックの 3D 再構成中に、Emcn+ 血管のマスクを作成することによって自動的に生成されました。 CD31+Ki-67+細胞核は、ImageJ (Fiji) のセルカウンター機能を使用して計数されました。 細胞の CD31+ 4-HNE (MFI) は、積分密度と平均グレー値を使用して ImageJ (フィジー) で生成されました。 バックグラウンド蛍光を差し引いて、いくつかの画像にわたる細胞あたりの補正された蛍光強度を取得しました。 Plin+ ATGL および HSL (MFI) は、4 ～ 5 個の骨サンプルのいくつかの画像にわたる脂肪滴あたりの統合密度と平均グレー値を使用して、同様の方法で計算されました。

上で説明したように、EC は抗体でコーティングされたビーズを使用して単離されました。 培養用に細胞をプレーティングする代わりに、細胞をRLT緩衝液(Qiagen)で溶解し、メーカーのガイドラインに従ってRNeasy Plus Micro Kit(Qiagen、74034)を使用してRNAを抽出した。 iScript cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad) をキットの説明書に従って使用して、全 RNA を cDNA に変換しました。 希釈した cDNA を、次の遺伝子のプライマーを使用して SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher Scientific) を使用して実行した qPCR に使用しました: Tgfb、Eng、Tie1、Pecam1、Itga5、Flt4、Flt1、Fgfr2、Sox18、Nrp1、Adipoq、Fabp4、Cyp1b1、 Lepr、Aldh1a2、TNFα、および Il6。 β-アクチンをハウスキーピング遺伝子として使用しました。

遺伝子欠失実験のために転写レベルでの遺伝子機能の喪失を確認するために、各遺伝子（Esr1、Esr2、Gper1、およびCpt1a）のプライマーを使用したqPCRのためにタモキシフェンを注射したトランスジェニックマウスの大腿骨からECを単離しました。 この研究で使用したプライマー配列を補足表 1 に示します。

反応は、CFX マネージャー 3.1 ソフトウェアを使用して CFX リアルタイム PCR マシン (Bio-Rad) で実行されました。 データはΔΔCt 法を使用して計算され、遺伝子発現倍率または相対的な mRNA レベルが示されました。

単離された骨 EC は、RLT バッファーを使用して溶解されました。 メーカーのガイドラインに従って、RNeasy Plus Micro Kit を使用して RNA を抽出しました。

2100 Bioanalyzer (Agilent) を使用して、個々のサンプルの RNA の品質をチェックしました。 RNA の品質に基づく各セットの上位 3 つのサンプルを、ライブラリー調製のためにさらに処理しました。 TruSeq Total RNA ライブラリー調製キット (Illumina) を使用して、メーカーのガイドラインに従ってライブラリーを調製しました。 ライブラリーは、100 ヌクレオチド長のペアエンドリードを備えた Illumina HiSeq 2500 プラットフォーム上の LMS Genomics Facility で配列決定されました。

データ分析: マウスゲノムアセンブリ GRCm39 STAR (バージョン 2.7.10a)45 を使用して、ペアエンド 100 bp RNA 配列リードをアライメントしました。 遺伝子ベースの読み取り数は、featureCounts (バージョン 2.0.1) を使用して取得されました 46。 カウントデータは、PCA による視覚化のために DESeq2 パッケージ 47 の分散安定化変換 (VST) 関数を使用して正規化されました。 DESeq2 を使用して、各年齢グループの男性と女性の間の遺伝子発現差分析を実行しました。 DE 遺伝子は、偽発見率 (FDR) 調整済み P < 0.05 を使用して選択されました (タンパク質コーディング)。 さらに、Ensembl ID には、biomaRt を使用して遺伝子シンボルと Entrez Gene ID に注釈が付けられました (参考文献 48)。 差次的に調節される遺伝子リストは、補足データセット 1 に提供されています。遺伝子セット濃縮分析は、GAGE (バージョン 2.42.0) を使用して実行されました 19。 機能アノテーションには、KEGG データベースの遺伝子セットを使用しました。 GAGE 分析は、女性サンプルを参照サンプルとして採取し、65 週間のデータから差次的に調節された遺伝子に対して実行されました。 有意な KEGG 用語は、P < 0.05 を使用して選択されました。

すべてのグラフの生成と統計分析には、GraphPad Prism バージョン 9.4.1 が使用されました。 各図に対して実行された統計は、対応する図の凡例に記載されています。 示されている場合、データセットに対して、スチューデントの対応のない両側 t 検定、または Tukey の多重比較検定後の一元配置または二元配置 ANOVA が実行されました。 生物学的データのエラーバーは平均±sdを示し、数値定量化の場合、エラーバーは平均±semを示します P<0.05は統計的に有意であるとみなされました。 サンプルサイズは、以前の実験と公開されたデータに基づいて選択されました。 すべてのデータは、同様の結果を再現するために少なくとも 2 つの独立した実験を使用して生成されました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

この研究のために生成された RNA-seq データは、受託番号 GSE163515 および GSE180246 で国立バイオテクノロジー情報センター遺伝子発現オムニバス データベースに寄託されています。 この研究の結果を裏付ける追加データは、主要な論文と関連ファイルに含まれています。 ソースデータはこのペーパーに付属しています。

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リファレンスをダウンロードする

マウス株を提供してくれた P. Carmeliet、SA Khan、RH Adams と、放射性アッセイプロトコルを提供してくれた P. Carmeliet と G. Eelen に感謝します。 R. Eastell、I. Miguel-Aliaga、そして洞察力に富んだ議論をしてくださったラマサミー研究室のメンバー全員に感謝します。 SKR は、ウェルカム トラストおよび王立協会のヘンリー デール卿フェロー (202300/Z/16/Z) です。 SKR は、この研究がウェルカム トラスト (202300/Z/16/Z)、王立協会 (RGS\R2\212421)、医学研究評議会 (A654-5QC60)、および米国骨学会から一部資金提供を受けていることを認めています。鉱物研究。 APK は、この研究が医学研究評議会 (CDA: MR/P02209X/1) および欧州研究評議会 (StG: metaNiche、805201) によって部分的に支援されていることを認めます。 SKR は、EMBO 若手捜査官プログラムのメンバーです。 オープンアクセスを目的として、この投稿から生じた著者承認済みの原稿バージョンには、CC BY 公共著作権ライセンスを適用しています。

インペリアル・カレッジ・ロンドン臨床科学研究所、ロンドン、英国

ジュリア・ロドリゲス、ミシェル・ヘンドリックス、サラヴァナ・K・ラマサミー

MRC ロンドン医科学研究所、インペリアル カレッジ ロンドン、ロンドン、英国

ジュリア・ロドリゲス、ミシェル・ヘンドリックス、サラヴァナ・K・ラマサミー

バイオインフォマティクスおよびコンピューティング施設、MRC ロンドン医科学研究所、インペリアル カレッジ ロンドン、ロンドン、英国

ワン・イーファン＆ゴープラジャ・ダルマリンガム

オックスフォード大学、MRC ウェザーオール分子医学研究所、MRC ヒト免疫学ユニット、組織および腫瘍微小環境グループ、オックスフォード、英国

アミット・シン & アンジャリ・P・クスンベ

ハイデルベルク大学生化学センター、ハイデルベルク大学、ハイデルベルク、ドイツ

アミット・シン

Bioscar Inserm U1132 およびパリ大学、ラリボワジエール病院、パリ、フランス

マーティン・コーエン・ソラール

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JR はほとんどの実験を設計および実行し、結果を解釈して図を準備しました。 Y.-FW、AS、GD は遺伝子発現データを分析しました。 MH はセルを分類し、原稿を準備しました。 APK は実験を設計し、結果を解釈しました。 著者全員が原稿を準備しました。 SKR は研究を発案、監督し、結果を解釈して原稿を執筆しました。

サラヴァナ・K・ラマサミー氏への通信。

著者らは、競合する経済的利害関係を宣言していません。

Nature Cardiovascular Research は、こ​​の研究の査読に貢献していただいた Philip Shaul、Joshua Farr、およびその他の匿名の査読者に感謝します。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

a、マウスの妊娠中および出産後のさまざまな時点でのOBL（Osterix+）および骨髄（BM）脂肪細胞（Perilipin+）の変化を示す代表的な共焦点画像。 スケールバーは40μm。 b、aに記載されているOBLおよびBM脂肪細胞の定量。それぞれ骨幹端（mp）の長さおよび面積に対して正規化されています（n = 5）。 データは平均値±標準偏差です。 Tukey 検定による一元配置分散分析。 c、マウスの妊娠中のさまざまな時点でのKi-67+ ECの定量化（mpの長さに正規化）（n = 5）。 データは平均値±標準偏差です。 Tukey 検定による一元配置分散分析。 d、VCDモデルにおけるOBLの損失とBM脂肪細胞の増加を示す定量化付きの代表的な共焦点画像（n = 5）。 データは平均値±標準偏差です。 対応のない両側 t 検定。 スケールバーは40μm。 e、P28でのビヒクルおよびE2処理骨の代表的な共焦点タイルスキャン。E2処理マウスにおけるH型血管(矢頭)の増加を示す。 白い点線は骨髄を皮質骨領域から分離します。 フローサイトメトリーによる H 型 EC (CD31high Emcnhigh) の定量化 (n = 6)。 データは平均値±標準誤差です。 Tukey 検定を使用した二元配置分散分析。 スケールバーは100μm。

ソースデータ

a、P28でさまざまなホルモンで処理したマウスのOBL（Osterix+、n = 5）およびBM脂肪細胞（Perilipin +、n = 5）の定量化を含む代表的な共焦点画像。 データは平均値±標準偏差です。 Tukey 検定を使用した二元配置分散分析。 スケールバーは40μm。 b、代表的な共焦点画像は、骨幹端および皮質骨領域のエンドムチン (Emcn、赤)、CD31 (緑)、α平滑筋アクチン (αSMA、シアン) 血管を示しています。 グラフは、ビヒクル、E2、P4、およびDHTで処理されたマウスにおけるCD31 + Emcn-細動脈（白い矢印）およびTCVの定量を示します（n = 5）。 データは平均値±標準偏差です。 Tukey 検定を使用した二元配置分散分析。 白い点線は皮質骨領域を示します。 DAPI は核対比染色です。 スケールバー 100 μm (TCV)。 50μm（細動脈）。 c、P28でのEdUを注射したビヒクルおよびE2処理マウスの代表的な共焦点画像。骨幹端（mp）の長さに正規化したEdU + ECの定量化（ビヒクル n = 4 F、n = 4 M; E2 n = 5 F、n = 4M)は、E2治療によるEdU+ ECの増加を示しています。 スケールバーは50μm。 Ki-67+ EC の代表的なフローサイトメトリープロット。骨内の Ki-67+ EC の定量化 (ビヒクル n = 4 F、n = 4 M、E2 n = 6 F、n = 4 M) は、Ki-67+ EC の増加を示します。 E2 処理を施した 67 以上の EC。 画像定量化データは、Tukey 検定を使用した二元配置分散分析による平均値 ± 標準偏差であり、フローサイトメトリー データは、Tukey 検定を使用した二元配置分散分析による平均 ± 標準誤差です。 d、代表的な共焦点画像とビヒクルおよびE2処理BECのKi-67+核の定量化（ビヒクルn = 11、E2 n = 10）。Ki-67+細胞の増加を示す複数の20倍の視野からの平均の定量化E2処理あり。 データは平均値±標準偏差です。 対応のない両側 t 検定。 スケールバーは50μm。 e、ビヒクルおよびE2処置マウスにおける血管新生遺伝子の相対的遺伝子発現を示すグラフ。これは、E2処置による血管新生の増加を示す。 (Tgfb 車両 n = 8、E2 n = 5; Eng 車両 n = 8、E2 n = 5; Tie1 車両 n = 6、E2 n = 5; Pecam1 車両 n = 8、E2 n = 5; Itga5 車両 n = 7 、E2 n = 5; Flt4 車両 n = 8、E2 n = 5; Flt1 車両 n = 5、E2 n = 4; Fgfr2 車両 n = 7、E2 n = 6; Sox18 車両 n = 8、E2 n = 8; Nrp1 車両 n = 7、E2 n = 6。) データは平均値 ± 標準誤差です。 複数の対応のない両側 t 検定。

ソースデータ

a、マウスの妊娠中のさまざまな時点での血清E2濃度を示すグラフ（dpc10.5、dpc17.5についてはn = 6;雄、ヴァージンF、dpc5.5、dpp0、dpp7についてはn = 5）。 データは平均値±標準誤差です。 Tukey 検定による一元配置分散分析。 b、P28マウス（n = 4 F、n = 4 M）および高齢マウス（n = 8 F、n = 7 M）の血清E2濃度を示すグラフ。 データは平均値±標準誤差です。 Tukey 検定を使用した二元配置分散分析。 c、H型（黄色、Emcnhigh CD31high）血管（すべての条件でn = 5）、OBL（Osterix +、n = 5）、およびBM脂肪細胞（Perilipin +、n = 5）の定量化を含む代表的な共焦点画像。ビヒクルおよびE2処理した偽手術マウスおよびOVXマウス。 総 EC (CD31 + CD45-Ter119-) のフローサイトメトリー定量化は、E2 処理骨における BEC の回復を示します (n = 5)。 データは、画像定量化の場合は平均 ± SD、フローサイトメトリー データの場合は平均 ± SEM です。 Tukey 検定を使用した二元配置分散分析。 スケールバーは50μm。 d、P28のビヒクルおよびレトロゾールで処理したマウスの骨組織切片をCD31（緑色）およびEmcn（赤色）で免疫染色し、H型血管を同定した。 グラフは、H 型 (黄色) 血管の定量化を示しています (n = 4)。 これらの骨切片における OBL と BM 脂肪細胞の分布は、Osterix + (シアン) と Perilipin (緑色) を使用して画像化されました。 グラフは、ビヒクルおよびレトロゾールで処理したマウスにおける OBL (n = 4) および脂肪細胞 (n = 4) の定量化を示しています。 データは平均値±標準偏差です。 Tukey 検定を使用した二元配置分散分析。 スケールバーは50μm。

ソースデータ

a、P28における女性および男性のBECにおけるエストロゲン受容体(Esr1、Esr2、Gper1)の相対mRNAレベルを示すグラフ。 (Esr1: n = 8 F、n = 7 M; Esr2、Gper1: n = 7) データは平均値 ± 標準誤差です。 対応のない両側 t 検定。 b、内皮Esr1、Esr2、またはGper1欠失変異体および対照同腹子の精製BECにおけるER転写レベルを示すグラフ（Esr1対照n = 6 F、n = 6 M、変異体n = 5 F、n = 5 M;Esr2対照n = 5 F、n = 5 M、変異体 n = 6 F、n = 5 M;Gper1 コントロール n = 5 F、n = 6 M、変異体 n = 5 F、n = 6 M）。 データは平均値±標準誤差です。 Tukey 検定を使用した二元配置分散分析。 c、同腹子Creコントロールと比較した、内皮Esr1、Esr2、またはGper1欠失を有する変異体の代表的な共焦点画像。定量化により、Esr1およびGper1欠失後のOBLの損失と脂肪細胞の増加が示されています（Esr1:Osx-Control n = 10 F、 n = 7 M、変異体 n = 9 F、n = 6 M; Esr1:Plin コントロール n = 9 F、n = 8 M、変異体 n = 8 F、n = 8 M; Esr2:Osx コントロール n = 5 F、n = 5 M、変異体 n = 6 F、n = 5 M; Esr2:Plin コントロール n = 5 F、n = 5 M、変異体 n = 6 F、n = 6 M; Gper1: Osx と Plin-コントロール n = 6 F、n = 7 M、変異体 n = 7 F、n = 7 M)。 データは平均値±標準偏差です。 Tukey 検定を使用した二元配置分散分析。 スケールバーは40μm。

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a、同腹子Cre対照と比較した内皮Esr1欠失変異体の代表的なmicroCT分析。定量化により、骨梁骨体積分率（BV/TV）、数、厚さおよび間隔（n = 4）、脂肪細胞の定量化（n = 4）が示されます。皮質骨の厚さと面積の定量化 (n = 4)。 代表的な共焦点画像は、破骨細胞数 (n = 6) と被覆率 (n = 5) の定量化により、コントロールおよび変異骨における破骨細胞の分布を示します。 データは、マイクロ CT 結果については平均 ± sem、画像定量化については ± SD です。 Tukey 検定を使用した二元配置分散分析。 スケール バー 100 μm (microCT)、50 μm (共焦点)。 b、同腹子Cre対照と比較した内皮Gper1欠失変異体の代表的なmicroCT画像。定量化により、骨梁骨体積分率（BV/TV）、数、厚さ、分離（n = 4）、脂肪細胞の定量化（n = 4）が示されています。 ）および皮質骨の厚さと面積の定量化（n = 4）。 代表的な共焦点画像は、破骨細胞数 (n = 6) と被覆率 (n = 5) の定量化により、コントロールおよび変異骨における破骨細胞の分布を示します。 データは、マイクロ CT 結果については平均 ± sem、画像定量化については ± SD です。 Tukey 検定を使用した二元配置分散分析。 スケール バー 100 μm (microCT)、50 μm (共焦点)。

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a、2週齢、12週齢、および65週齢のマウスからの精製雄および雌BECのクラスタリングを示すRNAseqデータのPCAプロット（n = 3）。 遺伝子発現パターンのサンプル相関ヒートマップは、年齢グループのクラスタリングを示します。 b、脂肪酸代謝に関連する遺伝子を示すヒートマップ。これらの遺伝子は、雄と雌の間で老化マウスBECで差次的に発現されます。 c、Cpt1a変異体のBM微小環境内の細胞タイプを示す代表的な共焦点画像と、mp1mmあたりのOsterix+細胞の定量化を示すグラフ（対照n = 6 F、n = 7 M;変異体n = 6 F、n = 6 M）。 mm2 面積当たりのペリリピン + 面積 (対照 n = 5 F、n = 6 M; 変異体 n = 5 F、n = 5 M)。 定量化された代表的なマイクロ CT 画像は、Cpt1a 変異体 (n = 4) における BM 脂肪細胞の体積の増加を示しています。 データは、画像定量化の場合は平均 ± SD、microCT データの場合は平均 ± SEM です。 Tukey 検定を使用した二元配置分散分析。 スケール バー 100 μm (microCT)、40 μm (共焦点)。 d、代表的な共焦点画像は、E2で処理した雄の対照マウスおよびCpt1aiΔEC変異体マウスにおけるOsx+細胞およびペリリピン+脂肪細胞を示しています。 グラフは、mp 1 mm あたりの Osx+ 細胞 (n = 5) および mm2 あたりのペリリピン + 細胞 (n = 5) の定量を示します。 データは平均値±標準偏差です。 Tukey 検定を使用した二元配置分散分析。 スケールバーは50μm。

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a、免疫染色は、雄マウスと雌マウスの両方のビヒクルおよびE2処理脛骨の血管（Emcn、赤）におけるFABP4発現（緑）を示します（n = 7）。 スケールバーは50μm。 b、ビヒクルおよびE2処理BECにおけるBODIPY結合合成FAの脂質取り込みの代表的な共焦点画像（n = 4）。フローサイトメトリーによる定量は、E2処理による脂質取り込みの増加を示しています。 データは平均値±標準誤差です。 対応のない両側 t 検定。 スケールバーは15μm。 c、ビヒクルおよびE2処理BECにおける細胞内脂質レベルの代表的な共焦点画像。 グラフは、ビヒクル条件および E2 条件で高い LipidTOX (n = 4) レベルを有する BEC のフローサイトメトリー定量化を示しています。 データは平均値±標準誤差です。 対応のない両側 t 検定。 スケールバーは15μm。 d、GPER1阻害剤G36処理時のビヒクルおよびE2処理BECにおけるBODIPY結合合成FAの脂質取り込みの代表的な共焦点画像。 定量化により、複数の 63 倍の視野にわたって、GPER1 阻害による内皮 BODIPY の蛍光単位の減少が示されます (溶媒 n = 37、溶媒 + G36 n = 30、E2 n = 39、E2 + G36 n = 30)。 データは平均値±標準偏差です。 Tukey 検定を使用した二元配置分散分析。 スケールバーは15μm。 e、エストロゲン受容体欠失Esr1 (コントロール n = 6 F、n = 6 M、変異体 n = 6 F、n = 6 M) および Gper1 (コントロール n = 6 F) を有するマウスにおける代表的な共焦点画像および内皮 FABP4 レベルの定量化、n = 6 M;変異体 n = 6 F、n = 6 M）。 データは平均値±標準偏差です。 Tukey 検定を使用した二元配置分散分析。 相対的な Fabp4 転写レベルも、同腹子対照と比較して、内皮 GPER1 (n = 4) および ESR1 (n = 4) 変異体からの精製内皮細胞で定量されました。 データは平均値±標準誤差です。 Tukey 検定を使用した二元配置分散分析。 スケールバーは50μm。

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a、Cpt1aおよびGper1変異体骨およびそれぞれの同腹子のBM脂肪細胞（ペリリピン+細胞）および脂肪分解酵素（ATGLおよびHSL）の代表的な共焦点画像。 スケールバーは50μm。 グラフは、Cpt1a における脂肪分解酵素 (ATGL および HSL) の減少を示す蛍光定量を示しています (ATGL: コントロール n = 23 F、15 M; 変異体 n = 23 F、24 M。HSL コントロール n = 19 F、36 M; 変異体) n = 42 F、54 M)、Gper1 (ATGL: コントロール n = 13 F、12 M; 変異体 n = 17 F、21 M。HSL: コントロール n = 19 F、50 M; 変異体 n = 37 F、49 M ) および Esr1 (ATGL: コントロール n = 75 F、72 M; 変異体 n = 63 F、62 M。HSL: コントロール n = 127 F、79 M; 変異体 n = 106 F、60 M) の欠失、複数にわたる細胞ごと20倍の視野。 データは平均値±標準偏差です。 Tukey 検定を使用した二元配置分散分析。 b、E2処理マウスの単離BECにおけるTnfaおよびIl6 mRNAの相対転写レベルを示すグラフ（溶媒 n = 5 F、n = 5 M; E2 n = 5 F、n = 5 M）、および内皮Cpt1aおよびGper1欠失変異体（コントロール n = 4 F、n = 4 M、変異体 n = 4 F、n = 4 M）。 データは平均値±標準誤差です。 Tukey 検定を使用した二元配置分散分析。 c、細胞から定量化されたTNFα（ビヒクルn = 12、E2 n = 12、E2 + G36 n = 6）およびIL-6（ビヒクルn = 12、E2 n = 12、E2 + G36 n = 6）レベルの増加を示すグラフビヒクル、E2およびE2 + G36で処理したBECの培養上清。 データは平均値±標準誤差です。 Tukey 検定による一元配置分散分析。

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a、代表的な共焦点画像は、E2で処理された高齢マウスのH型血管（黄色、Emcnhigh CD31high）、OBL（Osterix+）、およびBM脂肪細胞（Perilipin+）を示しています（溶媒n = 5 F、n = 5 M; E2 n = 5 F） 、n = 5M)。 スケールバーは40μm。 グラフは、ビヒクルおよびE2処置マウスの骨における総EC、H型血管、Osx+およびペリリピン+細胞の定量を示しています。 データは、フローサイトメトリーデータについては平均±sem、画像定量化については平均±sd、テューキー検定による二元配置分散分析です。 b、CD31（緑色）、エンドムチン（赤色）、α平滑筋アクチン（αSMA、シアン）について免疫染色した骨切片の共焦点画像は、ビヒクルおよびE2で処理した高齢マウスにおけるCD31 + Emcn-細動脈およびTCVの分布を示しています。 定量化グラフは、マウスにおける E2 投与後の細動脈と TCV (n = 5) の増加を示しています。 データは平均値±標準偏差です。 Tukey 検定を使用した二元配置分散分析。 スケールバーは50μm（細動脈）、100μm（TCV）。 c、ビヒクルおよびE2処理した若齢マウス（P28; n = 8）および高齢マウス（>60週; n = 4）の骨内皮における4HNEレベルの代表的な共焦点画像。 画像は、矢印で示された 4HNE の内皮発現を示す挿入図を示します。 スケールバーは50μm。 d、矢印で示された4HNEの内皮発現を示す挿入図を含むVCD閉経モデル（車両n = 5; VCD n = 5）。 データは平均値±標準偏差です。 対応のない両側 t 検定。 スケールバーは50μm。

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a、E2 治療後の増加を示す、高齢マウス (n = 5) における内皮 FABP4 発現の代表的な共焦点画像。 データは平均値±標準偏差です。 Tukey 検定を使用した二元配置分散分析。 スケールバーは50μm。 b、E2の存在下でビヒクルおよびFABP4阻害剤BMS 309403で処理した骨内皮細胞における4HNEレベルを定量化した代表的な共焦点画像。 定量化により、FABP4 阻害時に高い 4HNE レベルが示されましたが、これは E2 処理によって回復されませんでした (n = 6)。 データは平均値±標準偏差です。 Tukey 検定を使用した二元配置分散分析。 スケールバーは15μm。 c、対照、デフェロキサミン（DFM）またはアルテミシニン（Art）で処理したBECの代表的な共焦点画像。 グラフは、内皮 4HNE レベルの蛍光強度の定量化を示しています (Vehicle n = 24、E2 n = 26; Vehicle+DFM n = 26; E2 + DFM n = 27; Vehicle+Art n = 21; E2 + Art n = 23) データは平均±標準偏差です。 Tukey 検定を使用した二元配置分散分析。 スケールバーは15μm。 d、P28でのビヒクル（n = 5 F、n = 5 M）およびDFM処理マウス（n = 5 F、n = 6 M）の骨内皮における4HNEレベルを定量化した代表的な共焦点画像。 データは平均値±標準偏差です。 Tukey 検定を使用した二元配置分散分析。 スケールバーは50μm。 e、共焦点画像は、アルテミシニンで処理されたマウスのBM微小環境におけるH型血管、OBL、およびペリリピンの発現を示しています（Art）。 mp フィールドあたりの H 型血管体積 (ビヒクル n = 4 F、n = 5 M、アルテミシニン n = 4 F、n = 6 M)、mp 1 mm あたりの Osterix+ 細胞数 (ビヒクル n = 5 F、 n = 7 M、アルテミシニン n = 5 F、n = 6 M）、mp 面積当たりのペリリピン + 面積（ビヒクル n = 5 F、n = 5 M、アルテミシニン n = 5 F、n = 6 M）。 データは平均値±標準偏差です。 Tukey 検定を使用した二元配置分散分析。 スケールバーは50μm。 f、代表的なmicroCT 3Dレンダリング画像は、ビヒクルおよびリプロスタチン-1（Lip-1）で処理された高齢雄マウスの皮質骨を示しています。 グラフは、ビヒクル (n = 4 F、4 M) およびリプロクススタチン-1 (n = 4 F、4 M) で処理された老齢雄および雌マウスの皮質骨の厚さ (mm 単位) および皮質骨面積を示します。 データは平均値±標準誤差です。 Tukey 検定を使用した二元配置分散分析。 スケールバーは100μm。

ソースデータ

補足図。 1と2

異なる時点での男性と女性の BEC を比較した遺伝子発現データ

研究で使用されたプライマー配列

統計ソースデータ

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転載と許可

ロドリゲス、J.、ワン、YF.、シン、A. 他。 エストロゲンは、妊娠中および閉経期の骨の血管の健全性を強化します。 Nat Cardiovasc Res 1、918–932 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s44161-022-00139-0

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受信日: 2022 年 1 月 17 日

受理日: 2022 年 9 月 2 日

公開日: 2022 年 10 月 12 日

発行日：2022年10月

DOI: https://doi.org/10.1038/s44161-022-00139-0

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