男性のステロイドがマラリア蚊の女性の性行動を制御する

Nature volume 608、pages 93–97 (2022)この記事を引用

13,000 アクセス

2 引用

48 オルトメトリック

メトリクスの詳細

脊椎動物とは異なり、昆虫は男性に偏った性ステロイドホルモンを欠いていると広く考えられています1。 マラリア蚊ハマダラカハマダラカでは、エクジステロイド 20-ヒドロキシエクジソン (20E) が、雌によって合成された場合には卵の発育を制御し 2、雄によって性的に伝達された場合には交尾不応性を誘導するために進化したようです 3。 卵の発育と交配は重要な生殖形質であるため、ハマダラカの雌がこれらのホルモンシグナルをどのように統合するかを理解することは、新しいマラリア制御プログラムの設計を促進する可能性があります。 今回我々は、これらの生殖機能が、エクジステロイド活性化/不活性化酵素の高度なネットワークを介して、異なる性ステロイドによって調節されていることを明らかにする。 私たちは、男性特異的な酸化エクジステロイドである 3-デヒドロ-20E (3D20E) を同定し、これが性的転移と脱リン酸化による活性化の後に女性の性的受容性をオフにすることで父性を保護します。 注目すべきことに、3D20Eの導入は、プラスモディウム感染中に卵の発育を維持する生殖遺伝子の発現も誘導し、感染した雌の健康状態を確保します。 雌由来の 20E は性的不応性を引き起こしませんが、20E 阻害キナーゼが抑制されると交配個体の産卵を許可します。 この雄特有の昆虫ステロイドホルモンと、雌の性的受容性、生殖能力、およびマラリア原虫との相互作用の調節におけるその役割を特定したことは、マラリアを媒介する蚊の生殖成功率を低下させる可能性を示唆している。

ヒトのマラリア原虫の唯一の媒介者であるハマダラカの広範な殺虫剤耐性など、いくつかの要因により、マラリアの症例と死亡が再び増加しています4。 これらの蚊の交尾生物学は、メスが一度しか交尾しないため、新しいマラリア制御介入の特に魅力的な標的です。 この単一の交尾イベントを無菌化することは、野蚊の個体数を減らす大きな可能性を秘めています。

女性は男性から高力価のステロイドホルモンを投与されると性的受容性を失います。 研究によると、さらなる交尾に対する不応性の引き金は、幼虫期の脱皮周期の制御因子としてよく知られているステロイドホルモンである 20-ヒドロキシエクジソン (20E)3 であることが示唆されています 6。 20E を合成し伝達するオスの能力は、セリア亜属 7 のハマダラカ種のサブセットで特に進化しました。セリア亜属 7 は、アフリカに生息し、ガンビエハマダラカを含む最も危険なマラリアベクターを構成します 5。 これは特に注目すべきことである。なぜなら、これらの種では、採血のたびにメスによって20Eも生成され、それによって20Eが卵形成周期を駆動するからである（参考文献8で概説）。 しかし、雌が自らの交尾能力を損なうことなく、2つの異なるエクジステロイド源（移入された雄と吸血によって誘導された）から生じるシグナルを統合する方法は、ほとんどわかっていない。 実際、メスが生成する 20E によって性的不応症が引き起こされると、処女として吸血する個体に不妊が引き起こされることになるが、これはこれらの蚊の間で非常に一般的な行動である 5。

考えられる説明は、A. ガンビエの雄が、雌の生殖管内のシグナル伝達カスケードを活性化する修飾された雄特有のエクジステロイドを伝達し、それが交尾不応性を引き起こすというものである。 しかし、脊椎動物はエストロゲンやアンドロゲンなどの主に二形性の複数のクラスのステロイドホルモンを持っていますが（参考文献9で概説）、我々の知る限り、昆虫では男性に偏ったステロイドは確認されていません。

私たちは、性的に成熟した A. gambiae 雄の雄副腺 (MAG) におけるステロイド ホルモンの完全な組成を決定し、修飾ステロイドの可能性を探索することに着手しました。 以前に使用されていた特異性の低い方法ではなく、高速液体クロマトグラフィーとタンデム質量分析法 (HPLC-MS/MS) を組み合わせた 7、10、11 を使用して、この組織でエクジソン (E) と 20E を検出し、以前の結果を裏付けました。 しかし、サンプルは、化学式 3-デヒドロ-20E-22-リン酸 (3D20E22P)12 に一致する、酸化されリン酸化されたステロイドが大半を占めていました (図 1)。 他の形態には、3-デヒドロ-20E (3D20E) および 20E-22-リン酸 (20E22P) が含まれます。 3D20E22P の HPLC-MS/MS シグナル強度は、その脱リン酸化型 3D20E のシグナル強度より 2 桁高く、E および 20E のシグナル強度よりも 3 桁高かった (図 1)。 血液を与えて育てた雌では、検出可能なレベルの 3D20E22P または 3D20E は検出されませんでしたが、予想どおり、E および 20E (および低レベルの 20E22P) が体の残りの部分と下部生殖管 (LRT; 拡張データ図) で検出されました。 .1a)。 また、新しく羽化した（生後 1 日未満）オスとメスのエクジステロイドのプロファイリングを行ったところ、MAG でのみ 3D20E および 3D20E22P が検出されました。 E、20E、および 20E22P は雌雄両方に存在しました (拡張データ図 1b)。 これらのデータは、A. ガンビエの成体雄が、雌によって合成されない高力価の修飾ホルモンを MAG 内で産生することを示しています。

MAG と雌の LRT (心房、精嚢、および傍卵巣を含む) を、生後 4 日 (4 d) の未婚雄と未婚および交尾した雌 (0.5、3、および 12 hpm) から解剖しました。 これらの組織中のエクジステロイドは、HPLC-MS/MS によって分析されました (平均 ± sem、対応のない t 検定、両側、偽発見率 (FDR) 補正済み、NS、有意ではありません。*P < 0.05、**P < 0.01 3D20E: 3 時間対 0.5 時間、P = 0.035; 12 時間対 3 時間、P = 0.0015; 12 時間対 0.5 時間、P = 0.030。3D20E22P: 3 時間対 0.5 時間、P = 0.25; 12 時間対 3 時間、P = 0.0032; 12 時間対 0.5 時間、P = 0.015)。 データは 3 つの生物学的複製からプールされました。 対象のエクジステロイドごとにピーク面積を計算し、蚊の数で正規化しました。 エクジステロイドは次のように色で示されます: E、緑色。 20E、オレンジ。 20E22P、パープル。 3D20E、青。 3D20E22P、ピンク。 挿入図では、エクジステロイド レベルの低下を示すために、y 軸のスケールが大きくなります。

ソースデータ

3D20E22P と 3D20E が交配中に転移するかどうかを調べるために、交配後のさまざまな時点でメスの LRT を解剖しました。 処女個体ではエクジステロイドは同定されなかったが、交尾直後（交尾後0.5時間、hpm）のLRT中に大量の3D20E22Pが観察され、これは3D20Eレベルの有意な増加と並行して時間の経過とともに減少した（図1）。 化学合成された 3D20E を標準として使用して、交配 LRT におけるこのステロイド ホルモンのレベルが 20E のレベルより少なくとも 100 倍高いことを確認しました (拡張データ表 1)。 したがって、3D20E22P は交尾中に雌 LRT に移入される主要な雄エクジステロイドであり、その脱リン酸化型 3D20E は交尾直後に非常に豊富になります。 これは、雌の交配後の生物学における後者のエクジステロイドの顕著な役割を示唆しています。

新しいRNAシーケンス（RNA-seq）データセット（図2a）の生成後にカスタム構築されたバイオインフォマティクスパイプラインを使用して、20E修飾エクジステロイドキナーゼ（EcK）、エクジステロイドオキシダーゼ（EO）、およびエクジステロイドリン酸ホスファターゼをコードする遺伝子を検索しました（ EPP) は生殖組織で発現します。 我々は、1 つの候補 EPP 遺伝子と 2 つの潜在的な EcK 遺伝子 (EcK1 および EcK2) を同定しましたが、適切な候補 EO 遺伝子を見つけることができませんでした。 注目すべきことに、3D20E22Pの脱リン酸化がこの雌の組織で起こることを考えると、我々の予想に反して、単一のEPP遺伝子はA.ガンビエMAGでは高レベル（98.9パーセンタイル）で発現しましたが、雌のLRTでは発現しませんでした（図2b）。 したがって、我々は雄のEPPが交尾中に伝達される可能性があると考えました。 実際、我々は、雌タンパク質をマスクするための生体内安定同位体標識を使用して、交配後の雌の心房におけるMSによってこの酵素を同定した（図2cおよび補足表1）。 MAGおよび交配した（未処女ではない）雌LRTにおけるEPPの存在も、特異的抗体を使用して確認されました（図2d）。

a、各性別の生殖組織で EcK、EO、および EPP をコードする遺伝子を検索するために使用されるカスタム構築のバイオインフォマティック パイプライン。 矢印の横の数字は、各ステップの男性候補者と女性候補者の数を示します。 この分析により、雄で発現する 1 つの EPP 遺伝子 (EPP) と 1 つの EcK 遺伝子 (EcK1)、および両性で発現する 1 つの EcK 遺伝子 (EcK2) が同定されましたが、候補 EO 遺伝子は得られませんでした。 b、処女（V）および交配（M）A.ガンビアエおよびハマダラカハマダラカの組織における候補遺伝子の発現を比較するヒートマップ。 Spca、スペルマテカ。 MAG、雄付属腺。 体、男女とも胸部、羽、脚、脂肪体、内臓、女性の場合は卵巣を含む体の残りの部分。 EcK2 は A. gambiae の MAG と心房の両方で高度に発現していましたが、EPP は MAG でのみ見つかりました。 c、3、12、および24 hpmで女性の心房に移動した男性のエジャクロムのプロテオミクス分析。67の最も豊富なタンパク質が示されています。 メスは、すべてのタンパク質を標識（およびマスク）するために 15N を含む餌を与えて飼育されました。 標識されていない雄を標識された雌と交配し、雌の LRT をプロテオミクス分析のために 3、12、および 24 hpm で解剖しました (エジャクロムタンパク質の完全なリストについては補足表 1 を参照)。 挿入図、EPP、Eck1、および EcK2 は、これらの組織のプロテオミクス分析によって処女男性の MAG で検出されました。 d、EPPはMAGおよび交配したメスのLRTにおいてウェスタンブロットによって検出されたが、処女のメスまたはオスまたはメスの体の残りの部分では検出されなかった。 膜は、抗アクチン (ローディング コントロール) および抗 EPP 抗体で同時にプローブされました。 男性は全員処女でした。 ゲルソースデータについては、補足図 1 を参照してください。ウエスタンブロットを 2 回実行しましたが、同様の結果が得られました。

ソースデータ

EPP のエクジステロイドリン酸ホスファターゼ活性は、HPLC-MS/MS によって MAG から単離された 3D20E22P とインキュベートした後に検証されました（拡張データ図 2a）。 さらに、RNA媒介干渉（RNAi）によってEPPをサイレンシングすると、これらの雄の生殖組織でホスファターゼ活性の大幅な低下が検出され（図3a）、EPPをサイレンシングしたオスと交配したメスでは、脱リン酸化3D20Eの割合が大幅に低下しました。部分的な遺伝子サイレンシングにもかかわらず（図3b）（拡張データ図2b、c）。 逆に、同じ蚊では 20E22P/20E 比の有意な変化は検出されず、おそらくこの酵素の 3D20E22P に対する特異性が示唆されています (図 3b)。

a、二本鎖EPP RNA（dsEPP）または二本鎖GFP RNA（dsGFP）対照を使用したEPPサイレンシングによって引き起こされるMAGにおけるホスファターゼ活性の低下。 20 MAG のプールが各反復で使用されました (P = 0.0046、対応のある t 検定、両側) (個別の点で示されています)。 b、EPPサイレント雄と交配した雌は、3馬力での脱リン酸化3D20Eの割合が有意に低い（P = 0.0043、対応のないt検定、両側）一方、20Eレベルは影響を受けない（P = 0.063、対応のないt検定、両面）。 データは、それぞれ 13 匹、16 匹、および 19 匹の雌の 3 つのプールから得られた平均値 ± 標準誤差として表示されます。 c、EPPサイレント雄と交配した雌は、再交配率が有意に高かった（P = 0.0002、フィッシャーの正確検定、両側）。 雌は交尾状態を確実にするために最初に強制交尾された。 2日後、導入遺伝子の定量的PCR検出によって再交配率を評価するために、トランスジェニック精子を保有する追加の雄にそれらを曝露した。 d. EPP サイレント雄と交配した血液給餌雌では、生殖能力が大幅に低下し (P < 0.0001、マン・ホイットニー検定、両側)、卵数がわずかに減少します (P = 0.088、マン・ホイットニー検定、両側)一方、産卵率は影響を受けません（P = 0.94、フィッシャーの正確検定、両側）。 すべてのパネルにおいて、n は生物学的に独立した蚊サンプルの数を示します。 NS、重要ではありません。 *P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001、****P < 0.001。

ソースデータ

次に、エクジステロイドの脱リン酸化が雌の交尾不応性を誘導するのに重要であるかどうかを評価した。 注目すべきことに、追加の（トランスジェニック）雄に曝露した場合、EPP枯渇雄と交配した雌は、対照雌（10.4％）よりも実質的に高い頻度（44.9％）で再交配した（図3c）。 また、生殖能力の大幅な低下（図3d、左）と、これらのメスが産む卵の数のわずかな減少（図3d、中央）が観察されましたが、一方で、産卵するメスの割合（交尾によってメスに引き起こされる別の反応）は減少しました。 ) は影響を受けませんでした (図 3d、右)。 3D20E22Pに対するEPPの特異性が観察されたことを考慮すると、これらの結果は、交尾中に移入されたEPPによる3D20Eの活性化が、これまで20Eの性的伝達に起因すると考えられていた行動であるさらなる交尾に対するメスの受容性のスイッチを切るのに顕著な役割を果たしている可能性があることを示唆している。 したがって、この男性特有のホルモンは女性の生殖能力にも大きな影響を与えます。

次に、化学合成した3D20E（図4a〜c）と市販の20Eを使用して、性的に成熟した処女雌の注射実験で20Eと3D20Eの活性を比較しました。 我々は、2つの濃度において、3D20Eが20Eよりも雌の交尾に対する感受性をオフにするのに有意に効果的であることを観察した（図4d）。 注目すべきことに、最高濃度での注射の24時間後、LRT中の3D20Eの生理的レベルの半分（注射後1,066 pg対交配後2,022 pg）は、20Eの生理的レベル（361 pg）の20倍よりも高い割合の難治性雌を誘発した。注射後と交配後の 18 pg; 拡張データ表 1)。 この結果は、20E の性的転移は交尾不応性を誘発しないという考えと一致しており、さらに 3D20E が父性を確保する主な要因であることを示しています。 3D20Eはまた、処女雌の産卵アッセイにおいて20Eよりも有意に高い活性を示しました（図4e）。これは、部分的EPPサイレンシング後に観察された通常の産卵率は、残存3D20E活性の存在下での交配によって依然として誘発された雌因子によるものであることを示唆しています。

(a、b) 非常に高いレベルの変換/効率で 20E (a) から化学合成された 3D20E (データは平均 ± 標準誤差として示され、3 つの独立した合成反応から得られます) (b)。 c. 質量スペクトル (下半分) は、交配したメスの LRT で見つかったエクジステロイドの質量スペクトル (上半分) と完全に一致しました。 d、0.63 μgまたは0.21 μgの3D20Eの注射は、20E（0.63 μg、P = 0.02; 0.21 μg、P < 0.0001; フィッシャーの直接確率検定、両側）および10％エタノール対照（0.63 μg、 P < 0.0001; 0.21 μg、P < 0.0001; フィッシャーの直接確率検定、両側）、20E は高用量でのみ対照より有意に高かった（0.63 μg、P = 0.0002; 0.21 μg、P = 0.54; フィッシャーの直接確率検定、両面）。 e、3D20E注射は、処女雌において10％エタノール対照よりも有意に高い産卵率を誘発した（0.21μg、P < 0.0001; 0.13μg、P = 0.0003; フィッシャーの直接確率検定、両側）、20Eは対照と比較して有意であったのは、より高い用量 (0.21 μg、P = 0.022; 0.13 μg、P = 0.0823; フィッシャーの直接確率検定、両側)。 3D20E は、高用量で 20E よりも有意に高い産卵率を誘導しました (0.21 μg、P = 0.0019; 0.13 μg、P = 0.075; フィッシャーの直接確率検定、両側)。 すべてのパネルにおいて、n は生物学的に独立した蚊サンプルの数を示します。 NS、重要ではありません。 *P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001、****P < 0.001。 データは 3 つの複製からプールされました。

ソースデータ

以前の研究で、我々は、ステロイドホルモンの性的伝達が、最も致死性の高い熱帯熱マラリア原虫13の感染によって被る体力コストからA.ガンビエの雌を守る雌の生殖遺伝子であるMISO（卵形成の交配誘導刺激因子11）の発現を誘導することを明らかにした。人間のマラリア原虫。 マラリア流行地域におけるハマダラカの繁殖適性に対する MISO の重要性を考慮して、3D20E または 20E のどちらのホルモンがこの遺伝子の発現を引き起こすかを決定することにしました。 我々は、20E注射がHR3やHR4などの一部の核ホルモン受容体（HR）や卵黄形成遺伝子Vg14、15、16などの標準的な下流ステロイド標的を特異的に、またはより強力に誘導するのに対し、MISOは3D20Eによってより強力に誘導されることを発見した（拡張データ）図3）。 したがって、この男性ステロイドホルモンの性的伝達は、寄生虫感染によって生じるコストからメスを守るメカニズムを誘導すると考えられます。 さらに、3D20E は E 受容体 EcR の 2 つのアイソフォームに異なった影響を与え、EcR-A を誘導し、EcR-B を抑制し、雌の生殖能力に影響を与える HPX15 などの他の交配誘導遺伝子をより強力に誘発しました 17。 これは、EPP サイレント雄と交配した雌で観察される重大な不妊症を説明する可能性があります (拡張データ図 3)。 これらのデータは、特に性特異的機能の根底にある可能性がある 2 つのエクジステロイドによって優先的に活性化される下流経路の存在を示唆しています。

次に、バイオインフォマティクス パイプラインで特定された 2 つの EcK 遺伝子の機能をテストしました。 EcK1またはEcK2のいずれかをサイレンシングすると、雄で有意な死亡率が誘導され（拡張データ図4a）、エクジステロイドのリン酸化、つまり不活性化12が生存に重要であることが示されました。 EcK2はEcK1よりも高いレベルで発現し、プロテオミクスによってMAGで検出されたため（図2b、cおよび補足表2）、リン酸化20E22Pを生じた20Eとインキュベートすることによってエクジステロイドキナーゼ活性を検証しました（拡張データ図2）。 4b）。 代わりに3D20Eを基質として使用した場合、リン酸化生成物3D20E22Pは検出できませんでした(拡張データ図4c)。これは、3D20Eではなく20EがEcK2の好ましい標的である可能性があることを示しています。

我々のRNA-seq分析によると、EcK2は処女メスのLRTでも高度に発現しており、交尾後にオフになる（図2b）。 我々はこれらのデータを確認し、EcK2発現が吸血の影響を受けないことを確認しました（拡張データ図5a）。 最初の MS 実験を拡張して、20E22P のピークが 20E のピークをよく反映していることを確認しました（血液粉砕後 22 ～ 26 時間、拡張データ図 5b）。 処女雌におけるEcK2のサイレンシングにより、採血後26時間で20E対20E22Pの相対比が3倍増加し(拡張データ図2cおよび5c)、EcK2が雌でも20Eをリン酸化することが確認された。 注目すべきことに、EcK2枯渇処女は完全な性的受容性を維持しており（拡張データ図5d、e）、これは雌が産生する20Eが交尾不応性を誘発しないことをさらに示しています。 しかし、これらの雌は対照と比較して産卵率の大幅な増加を示し、処女の30％以上が卵を産卵しました（拡張データ図5f）。 吸血後に二本鎖 Eck2 RNA (dsEcK2) 注射を行った場合、吸血によって誘導された 20E ピークがすでに低下していた場合、産卵は起こりませんでした。 全体として、これらの結果は、吸血後に産生される20Eが産卵を誘発するが、それは交配によって産卵ブロック（EcK2およびおそらく他の要因）がオフになった場合に限られるというモデルを裏付けるものである。 20E 注射も 3D20E 注射も処女では EcK2 発現を抑制しませんでした (拡張データ図 5g)。これは、他の因子がこのキナーゼの抑制を媒介していることを示しています。 しかし、吸血後の20Eレベルは交尾に対する不応性を誘発するのに十分ではなく、代わりに性的に移入された高力価の3D20Eによって効率的に誘発される。

私たちの結果は、A. gambiae の生殖成功を制御するメカニズムについての重要な洞察を提供します。 オスが、さらなる交尾に対してメスを特異的に脱感作することによって父性を保証する、オス特異的な修飾エクジステロイドである3D20Eを高力価で合成するように進化したというモデルが出現した。 並行して、これらのマラリアベクターは、男性特異的EPPの性的伝達に基づいて女性の3D20Eを活性化する効率的なシステムも進化させた。 私たちの知る限り、これは昆虫において異なる重要な機能を発揮する雄と雌の優勢なステロイドホルモン系の最初の例です。 男性特有のエクジステロイド機能の存在は仮定されているが、明確には証明されていない。 たとえば、そのような機能は 20E 前駆体 E1 によって実行される可能性があるという仮説は大きく反証されています 18。 ショウジョウバエでは、特定の性ペプチド受容体 21,22 を介して雌の生殖管を神経支配するニューロンと相互作用する小さな性ペプチド 19,20 の性伝達によってモナンドリーが引き起こされることが十分に確立されている。 A. gambiae の雌において 3D20E によって制御される下流のシグナル伝達カスケードを同定し、これらのカスケードが蚊とショウジョウバエの間で保存されるかどうかを判断するには、さらなる研究が必要である。

私たちの研究で決定されたメスの生殖能力と行動に対する3D20Eの重要な役割を考えると、3D20Eの合成と活性化に至る経路は、不妊昆虫技術戦略23での野放し用の競争力のある不妊雄の生成や3D20Eの模倣など、将来の蚊の防除戦略に新たな機会を提供する。処女の女性では機能します。 3D20E の雄特有の機能は、A. ガンビエや他の Cellia 種が精液を凝固させて交尾プラグにする能力を獲得したときに進化した可能性があります 7。これにより、大量のホルモンやホルモン活性化酵素の効果的な移動が可能になったためです。 次に、モナンドリーを強制するための 3D20E の進化により、マラリアの流行地域での生殖適性を促進する機構 (MISO の高発現を通じて) がメスに備わり、これが間接的にプラスモディウム原虫の蔓延を促進します。 メスの 20E がハマダラカのメスにおける熱帯熱マラリア原虫の生存と成長に重大な影響を与えることが示されていることを考えると 24、現在、オスとメスの両方のステロイド ホルモン経路が蚊と寄生虫の相互作用における重要な側面となっています。

A. gambiae G3 株は、標準的な昆虫条件 (26 ～ 28 °C、相対湿度 65 ～ 80%、明暗日長 12:12 時間) で飼育されました。 幼虫には粉末の魚の餌（テトラミン トロピカル フレーク、コイ ペレット、およびテトラ ポンド スティックを 7:7:2 の比率で）を与えました。 成虫の蚊には、10% グルコース溶液を自由に与え、人間の血液 (Research Blood Components) を毎週与えました。 未処理の蚊は、ターミナルの顕微鏡検査の後、蛹の段階で雌雄を分離することによって得られました。 DsRed 導入遺伝子を保有する雄は以前に報告されています 25。

強制交配実験は、以前に記載されたプロトコルに従って実施されました13。 自然交配の場合、生後 4 日の処女メスを、性的に成熟した処女オスと 1:3 の比率で 2 晩飼育しました。 dsEPPを注射した雄を用いた実験では、ホスファターゼ活性が最大限に抑制された注射後3〜4日目と同時ケージングが行われました（拡張データ図2b）。

蚊の組織、残りの死骸（体の残りの部分）、または全身を 100% メタノール中で解剖し、ビーズビーター (2 mm ガラスビーズ、2,400 rpm、90 秒) で均質化しました。 組織の数とメタノールの量は次のとおりです。体の残りの部分は 1,000 μl 中に 50 個。 MAG、80 µl 中に 50 ～ 100。 女性 LRT、80 μl 中に 25 ～ 50 個。 同量のメタノールを使用して、ペレットに対して２回目のメタノール抽出を行った。 細胞破片を遠心分離により除去した。 2 回の抽出からのメタノールを合わせて窒素流下で乾燥し、次の量の 80% メタノール水溶液に再懸濁しました。本体の残りの部分、50 μl。 MAG およびメス LRT、30 μl。

サンプルは、LC 機器 (Vanquish、Thermo Fisher) に接続された質量分析計 (ID-X、Thermo Fisher) で分析されました。 5 マイクロリットルのサンプルを、25 °C に維持した 3 µm、100 × 4.6 mm カラム (Inspire C8、Dikma) に注入しました。 LC の移動相は A (水、0.1% ギ酸) および B (アセトニトリル、0.1% ギ酸) でした。 LC グラジエントは以下の通りでした: 5% B で 1 分間、その後 11 分で 100% B まで増加しました。 100% で 8 分後、カラムを 5% B で 4 分間再平衡化しました。 流量は0.3ml/分であった。 MS ソースでのイオン化は、ポジティブ モードとネガティブ モードでの加熱エレクトロスプレー イオン化によって行われました。

質量分析計は、m/z 範囲 350 ～ 680 にわたって分解能 60,000 のフル MS モードでデータを測定しました。MS/MS データは、[M + H]+ (すべてのターゲット)、[M − H2O + H] で取得されました。 + (すべてのターゲット) および [M - H]- (リン酸化されたターゲット)。 MS/MS データは、標準が利用できないターゲットのエクジステロイドの性質を確認するために使用されました。 標的とされていないエクジステロイドを同定するために、相対存在量が 15% を超えるすべての HPLC ピークの MS/MS データを分析しました。 定量化は、純粋な標準 (20E、3D20E) から作成された標準曲線を使用して絶対量を計算するか、1 つの特定のサンプル (他のすべてのターゲット) の希釈を使用して、1 人の男性で見つかった量との同等性を計算して行われました。 3D20E については、次の付加物の合計を使用して定量を実行しました: [M + TFA]-、[M + COOH]-、[M + Na]+、[M + Cl]-、[M + NO3]-。 Tracefinder (バージョン 4.1) を使用してデータを抽出し、定量化しました。 MS/MS データは、Xcalibur (バージョン 4.4) を使用して分析されました。 E、20E、および 3D20E の MS スペクトルをそれぞれの標準と比較しました。 3D20E22P は、ジラール試薬を用いた誘導体化によって分析されました。 20E22P は m/z 比によって分析されました。

3D20E22P を MAG から精製しました。 精製は、四重極質量ベース検出器 (QDa、Acquity、Waters) と組み合わせた超高性能液体クロマトグラフィー装置 (Acquity、Waters) を使用して、HPLC-MS/MS 分析と同じ LC 条件下で分析スケールで実行されました。 3D20E22P に対応する m/z が以前に同定されたものと同じ保持時間で検出されたときに、画分の収集が開始されました。 次に、抽出した化合物の純度を、上記のように HPLC-MS/MS によってチェックしました。

メーカーの指示に従って、TRI 試薬 (Thermo Fisher) を使用して、10 ～ 12 個の生殖組織または体の残りの部分 (ヘッドレス) のプールから全 RNA を抽出しました。 RNAをTURBO DNase (Thermo Fisher)で処理しました。 cDNAは、モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素(M-MLV RT; Thermo Fisher)を製造業者の指示に従って使用して合成した。 逆転写による定量的 PCR (RT-qPCR; 拡張データ表 2) に使用されるプライマーは、以前に公開されている 24 か、サイズ 70 ～ 150 bp の産物およびエクソン-エクソン接合部にまたがるプライマーまたはプライマー ペアを優先して Primer-BLAST26 を使用して設計されました。別々のエクソン。 RT-qPCR では、3 ～ 4 つの生物学的複製からの cDNA サンプルを水で 4 倍に希釈しました。 定量は、1× PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher)、プライマー、および 5 μl の希釈 cDNA を含む 15 μl の二重反応液で実行しました。 反応は QuantStudio 6 Pro リアルタイム PCR システム (Thermo Fisher) で実行され、データは Design and Analysis (バージョン 2.4.3) を使用して収集および分析されました。 相対量はリボソーム遺伝子 RpL19 (AGAP004422) に対して正規化されており、この研究で確認されたように、その発現は吸血 27 または交配 3 によって大きく変化しません。

RNA の品質は、Agilent バイオアナライザー 2100 Bioanalyzer (Agilent) でチェックしました。 イルミナのペアエンド ライブラリーは、MIT とハーバード大学のブロード研究所で調製され、実行されました。 デフォルトのパラメーターを備えた HISAT2 (バージョン 2.0.5) を使用して、シーケンシングリードを A. gambiae ゲノム (PEST 株、バージョン 4.12) にアライメントしました。 マッピング品質 (MAPQ) スコアが 30 未満の読み取りは、Samtools (バージョン 1.3.1) を使用して削除されました。 遺伝子にマッピングされたリードの数は、htseq-count (バージョン 0.9.1) をデフォルトのパラメーターで使用してカウントされました。 正規化リード数の計算と差次的遺伝子発現の分析は、R (バージョン 4.0.3) の DESeq2 パッケージ (バージョン 1.28.1) を使用して実行されました。

エクジステロイド修飾遺伝子候補は、まずデフォルトのアルゴリズムを使用して PSI-BLAST アルゴリズム (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/) で A. gambiae ゲノムを検索することによって同定されました。以下のクエリタンパク質配列を持つパラメーター:Bombyx mori (アクセッション NP_001038956.1)、Muscadomestica (アクセッション XP_005182020.1、XP_005175332.1 および XP_011294434.1) および Microplitis demolitor (アクセッション XP_008552646.1 および XP_008552645) の EcK .1）; B. mori (アクセッション NP_001036900)、Drosophila melanogaster (アクセッション NP_651202)、Apis mellifera (アクセッション XP_394838) および Acyrthosiphon pisum (アクセッション: XP_001947166) からの EPP。 および B. mori (アクセッション NP_001177919.1 および NP_001243996.1) および D. melanogaster (アクセッション NP_572986.1) からの EO (ステップ 1)。 次に、A. gambiae の生殖組織 (雌 LRT または MAG) における高い mRNA 発現 (100 万マッピング リード (FPKM) 当たりのエクソン 1 キロベースあたり 100 を超えるフラグメント、または 85 パーセンタイルを超える) に基づいてヒット遺伝子をフィルター処理しました (ステップ 2)。 。 特異性を向上させるために、交配中にエクジステロイドを合成または伝達しないハマダラカ種である A. albimanus の生殖組織でも発現する候補酵素を選択しました。 候補遺伝子は、A. albimanus の生殖組織における低発現 (<100 FPKM または <85 パーセンタイル) に基づいてフィルタリングされました (ステップ 3)。 最終的なフィルター (ステップ 4) として、候補遺伝子は次の少なくとも 1 つを満たす必要がありました: (1) 差次的に発現された遺伝子の分析による交配後の有意な上方制御 (P < 0.05)、および (2) 非発現遺伝子の欠如-生殖組織（85パーセンタイル未満または100FPKM未満）。

我々は、生物全体の同位体標識を達成するために、以前に記載された方法28、29、30を修正した。 簡単に説明すると、野生型出芽酵母 II 型 (YSC2、Sigma) を、(wt/vol) 2% グルコース (G7528、Sigma)、アミノ酸および硫酸アンモニウムを含まない 1.7% 酵母窒素塩基 (BD Difco、DF0335) を含む培地で増殖させました。 ）および唯一の窒素源としての 5% 15N 硫酸アンモニウム（NLM-713、>99%、Cambridge Isotope Laboratories）。 酵母を遠心分離によって回収し、蛹になるまで蚊の幼虫に自由に与えた。 4 齢期での死亡を防ぐために、粉末の魚の餌を補充しました (幼虫 300 匹あたり 0.5 mg)。 次に、交尾中に移入された雄のプロテオームを分析するために、雌のみを標識のない雄との交配実験に使用した。

生後 4 ～ 6 日の 15N 標識未使用メスを、年齢が一致した未標識未使用オスと強制交配させた。 嵌合が成功したことは、落射蛍光顕微鏡下で嵌合プラグが検出されることによって確認された。 3、12、および 24 hpm で、45 ～ 55 匹の交配雌の心房を 50 μl の重炭酸アンモニウム緩衝液 (pH 7.8) に入れ、乳棒でホモジナイズしました。 ホモジネートを遠心分離し、上清を５０ｍＭ重炭酸アンモニウム中の０．１％ＲａｐｉＧｅｓｔ（１８６００１８６０、Ｗａｔｅｒｓ）５０μｌと混合した。 各サンプルの上清とペレットはドライアイス上で急速冷凍され、一晩かけてワシントン大学の MacCoss 研究室に輸送され、そこで LC-MS/MS 用のサンプル前処理が完了しました。 ペレットを50mM重炭酸アンモニウム中の0.1% RapiGest 50μlに再懸濁し、水浴中で超音波処理した。 ペレットと上清の両方のタンパク質濃度をBCAアッセイによって測定し、サンプルを5 mM ジチオスレオトール（DTT; Sigma）で還元し、15 mM ヨードアセトアミド（Sigma）でアルキル化し、トリプシンで37℃で1時間（1:50）消化しました。トリプシン：基質比）。 RapiGest は、200 mM HCl を添加して切断し、その後 37 °C で 45 分間インキュベートし、4 °C で 14,000 rpm で 10 分間遠心分離して破片を除去しました。 サンプルをデュアルモード固相抽出 (Oasis MCX カートリッジ、Waters) によって洗浄し、最終タンパク質濃度 0.33 μg μl-1 になるように 0.1% ギ酸に再懸濁しました。 未標識の MAG プロテオームも同様に処女男性から分析されました。 各サンプルについて 2 つの分析反復を分析しました。 次に、25 cm 溶融シリカ 75 μm カラムと、Jupiter C12 逆相樹脂 (Phenomenex) をロードした 4 cm 溶融シリカ Kasil1 (PQ) フリット トラップを 180 分 LC で使用して、各サンプル消化物 1 μg を分析しました。 –MS/MS は、nanoACQUITY UPLC システム (Waters) と組み合わせた Q-Exactive HF 質量分析計 (Thermo Fisher) で実行されます。 各実行から生成されたデータ依存の取得データは、Proteowizard (バージョン 3.0.20287) を使用して mzML 形式に変換され、Comet31 (バージョン 3.2) を使用して、A. gambiae (VectorBase release 54)、ハマダラカのタンパク質配列を含む FASTA データベースに対して検索されました。 Mali-NIH (VectorBase release 54)、S. cerevisiae (Uniprot、2021 年 3 月)、A. gambiae RNA-seq および既知のヒト汚染物質の 3 フレーム翻訳。 ペプチドスペクトル一致 FDR は Percolator32 (バージョン 3.05) を使用して閾値 0.01 で決定され、ペプチドは Limelight33 (バージョン 2.2.0) のタンパク質節約を使用してタンパク質同定に組み立てられました。 相対的なタンパク質存在量は、前述のように各実行内の各タンパク質について計算された正規化スペクトル存在量係数 (NSAF) を使用して推定されました 28。 各タンパク質に対する NSAF は、2 つの異なる生物学的複製からのサンプル全体で平均されました。 15N 標識は雌プロテオームをうまく隠すことに成功しましたが、標識された未使用のタンパク質から少数の未標識タンパク質が検出できました。 HPLCの「キャリーオーバー」の結果、雄/交尾サンプルの後に処女サンプルを分析する技術的実行においてのみ、女性の処女サンプル中の男性タンパク質の検出量が減少した(1〜5スペクトル)ことを記録しました。 ラベル付き処女からの「汚染物質」として時折発見されるタンパク質を補足表1にリストします。

カスタマイズされた抗体サービスの一環として提供される抗原性、表面露出確率、親水性の予測に基づいて、EPP タンパク質配列から 2 つの抗原ペプチド QTTDRVAPAPDQQQ (アイソフォーム PA 内) および MESDGTTPSGDSEQ (アイソフォーム PA および PB の両方内) が同定されました。ジェンスクリプトで。 2 つのペプチドをプールし、キャリアタンパク質 KLH と結合させてニュージーランドウサギに注射しました。 ウサギは 4 回目の注射後に屠殺し、アフィニティー精製で総 IgG を単離しました。 最も EPP 特異的なウサギからの IgG をさらなるウェスタンブロッティングに使用しました。

ウェスタンブロッティングでは、MAG (n = 10、n は生物学的に独立した蚊サンプルの数を示します) と雌の LRT (n = 30) を生後 4 日の未使用の雄と未使用または強制交配された雌 (<10 分) から解剖しました。交配後）をそれぞれタンパク質抽出緩衝液（50 mM Tris、pH 8.0; 1% NP-40; 0.25% デオキシコール酸ナトリウム; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1×プロテアーゼ阻害剤混合物（Roche））に添加しました。 サンプルは、ビーズビーター (2 mm ガラスビーズ、2,400 rpm、90 秒) で切断後すぐに均質化されました。 不溶性の破片を、4℃、20,000gでの遠心分離によって除去した。 タンパク質をブラッドフォードアッセイ(Bio-Rad)により定量した。 次に、20 μg の MAG タンパク質、40 μg の LRT タンパク質、および 20 μg の残りの本体タンパク質を変性し、MOPS バッファーを使用した 10% Bis-Tris NuPAGE で分離しました。 iBlot2 転写システム (Thermo Fisher) を使用して、タンパク質をポリ二フッ化ビニリデン膜に転写しました。 メンブレンを1×PBS-T（PBS中0.1% Tween-20）で2回洗浄し、次にOdyssey Blocking Buffer（Li-Cor）中で22℃で1時間ブロックしました。 メンブレンをカスタムウサギ抗 EPP ポリクローナル一次抗体 (ブロッキングバッファー中 1:700) およびラット抗アクチンモノクローナル一次抗体 MAC237 (Abcam; 1:4,000) とともに 4 °C で一晩振盪しながらインキュベートしました。 メンブレンをPBS-Tで洗浄し、0.01% SDSおよび0.2% Tweenを含むブロッキング緩衝液中で二次抗体（ロバ抗ウサギ800CWおよびヤギ抗ラット680LT（Li-Cor）、両方とも1:20,000）とともにインキュベートしました。 -20℃、22℃で1時間。 メンブレンを PBS-T で洗浄し、Odyssey CLx スキャナーで画像化しました。 画像は Image Studio (バージョン 5.2) で収集および処理されました。 EPP-RA アイソフォーム (82 kDa) に対応する特定のバンドは検出されませんでした。

EPP (ヒスチジンホスファターゼドメインを含むアイソフォーム AGAP002463-RB、NCBI Conserved Domain Search34) および EcK2 (AGAP002181) のコード領域を pET-21a(+) プラスミド (Novagen Millipore Sigma) にクローニングしました。 プライマーは拡張データ表 2 にリストされています。8 つの GS4 リンカー (タンデム) を、pET-21a(+)-EcK2 構築物の C 末端 6×His タグの前に挿入しました。 組換えタンパク質は、NEBExpress 無細胞大腸菌タンパク質合成反応 (New England BioLabs) を使用して生成されました。 組換えタンパク質をNEBExpress Niスピンカラム(New England BioLabs)を用いて精製した。 ジヒドロ葉酸レダクターゼ (DHFR) コントロール タンパク質は、NEBExpress 無細胞大腸菌タンパク質合成キットの DNA テンプレートを使用して生成されました。 タンパク質は 50% グリセロール PBS 中で -20 °C で最長 3 か月間保存されました。

EPP および組織抽出物のホスファターゼ活性は、4-ニトロフェニル リン酸 (pNPP; Sigma-Aldrich) を使用して測定しました。 反応バッファーには、25 mM Tris、50 mM 酢酸、25 mM Bis-Tris、150 mM NaCl、0.1 mM EDTA、および 1 mM DTT が含まれていました。 組織を反応緩衝液中でホモジナイズし、細胞破片を遠心分離によって除去した。 反応は、2.5 mg ml-1 pNPP を含む反応緩衝液に酵素または組織抽出物を添加することによって開始されました。 反応混合物を室温、暗所でインキュベートし、様々な時間で405nmでの吸収を測定することにより、pNPPから変換されたpNPの量を定量した。

in vitro EcK 活性の場合、タンパク質を、10 mM HEPES-NaOH、0.1% BSA、2 mM ATP、および 10 mM MgCl2 を含むバッファー (pH 7.5) 200 μl 中で 0.2 mg の 20E または 3D20E と 27 °C で 2 時間インキュベートしました。 。 メタノール800μlを加えて反応を停止させ、-20℃で1時間冷却し、続いて4℃、20,000gで10分間遠心分離した。 次に、上清を HPLC-MS/MS によって分析しました。 対照群で使用したタンパク質を熱不活化するために、タンパク質を 50% グリセロールの PBS 中で 95 °C で 20 分間インキュベートしました。

in vitro EPP 活性については、25 mM Tris、50 mM 酢酸、 25 mM Bis-Tris、150 mM NaCl、0.1 mM EDTA、1 mM DTT を 27 °C で 3 時間。 メタノール400μlを加えて反応を停止させ、-20℃で1時間冷却し、続いて20,000gで4℃で10分間遠心分離した。 上清を HPLC-MS/MS で分析しました。

EPP (362 bp)、EcK1 (AGAP004574、365 bp)、および EcK2 (556 bp) の PCR フラグメントを、雌雄混合の無頭蚊の死骸から調製した cDNA から増幅しました。 eGFP コントロールの PCR フラグメント (495 bp) は、前述の pCR2.1-eGFP から増幅されました 11。 PCR プライマーは拡張データ表 2 にリストされています。PCR フラグメントは、pL4440 プラスミド上の逆向き T7 プロモーターの間に挿入されました。 プラスミド構築物はNEB 5-αコンピテント大腸菌（New England Biolabs）から回収され、使用前にDNA配列決定によって検証されました（挿入配列については補足データ1を参照）。 T7 プロモーター (拡張データ表 2) に一致するプライマーを使用して、pL4440 ベースのプラスミドからインサートを増幅しました。 PCR産物のサイズはアガロースゲル電気泳動によって確認されました。 Megascript T7 転写キット (Thermo Fisher) を使用して dsRNA を PCR テンプレートから転写し、前述の修正を加えた製造業者の指示に従って精製しました 35。

dsRNA 注射の場合、羽化から 1 日以内に、1,380 ng の dsRNA (dsGFP、dsEcK1、dsEcK2、dsEPP) を 10 ng nl-1 の濃度で成人男性または女性の胸部に注射しました (Nanoject III、Drummond)。 遺伝子ノックダウンレベルは、RNA抽出、cDNA合成、およびRT-qPCRによって少なくとも3回の生物学的複製で決定されました。 エクジステロイド注射の場合、実験デザインに応じて、生後 4 日の処女または生後 6 日の処女血を与えられた雌に、0.13、0.21、または 0.63 μg の 20E または 3D20E を濃度で注射しました (Nanoject III、Drummond)。それぞれ、1.3、2.1、または6.3 ng nl−1。 10 パーセント (vol/vol) エタノール水溶液を 100 nl の量で注入しました。 10%エタノール中の3D20E22Pを100nlの量で注入した(一対のMAGで見出される量の75%に相当)。 蚊は注射グループにランダムに割り当てられました。

産卵アッセイでは、生後 3 日のメスにヒトの血液を自由に給餌しました。 部分的に餌を与えられた蚊または餌を与えられなかった蚊を除去した。 治療法に応じて、採血後少なくとも 48 時間後にメスを個別の産卵カップに入れて 4 晩放置しました。 卵は実体鏡（Stemi 508、Zeiss）の下で数えられました。 交尾したメスの場合、孵化して幼虫になった卵は有精卵として記録されました。

交尾アッセイでは、処理に応じて、メスが交尾に対する抵抗力を発現するまで最低 2 日間放置し、その後、年齢が一致した野生型のオスを同じケージに導入しました。 2 晩後、メスから精嚢を解剖し、10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA、25 mM NaCl (pH 8.2) を含む緩衝液中での凍結融解と超音波処理によってゲノム DNA を放出しました。 サンプルをプロテイナーゼ K (0.86 μg μl-1) とともに 55 °C で 15 分間、続いて 95 °C で 10 分間インキュベートしました。 粗ゲノム DNA 調製物を 10 倍に希釈し、Y 染色体配列の qPCR 検出に供しました。 プライマーは拡張データ表 2 にリストされています。Y 染色体配列の欠如は、交配がないことを示しています。

再交配アッセイでは、強制交配された雌は交尾状態を確認するために交尾プラグの存在をチェックされ、以前に記載されているように、雄の不在下での交尾に対する不応性を発現するまで 2 日間放置されました 36。 続いて、DsRed トランスジェニック精子を保有する雄を雌のケージに導入しました。 2 晩後、雌から精嚢を解剖し、上記のようにゲノム DNA を調製し、DsRed 導入遺伝子の qPCR 検出に供しました。 プライマーは拡張データ表 2 にリストされています。DsRed 導入遺伝子が存在しないことは、再交配が発生していないことを示しています。

3D20E は前述のように合成されました 37。 簡単に説明すると、10 mgの20E (Sigma-Aldrich)を10 mlの水に溶解し、次いで30 mgの白金黒(粉末形態、Sigma-Aldrich)を加えた。 Ｏ ２ ガスの穏やかな流れを反応混合物中に連続的に吹き込み、それを室温で撹拌した。 ６時間後、メタノール３０mlを加えて反応を停止させた。 混合物を遠心分離し、触媒ペレットを除去した。 上清を真空下、室温で蒸発乾固させた。 乾燥した反応生成物を注射用には 10% エタノールに、HPLC-MS/MS 分析用にはメタノールに溶解しました。 変換率（20Eから3D20Eへ）は約97％であり（図4b）、合成された3D20EのMSスペクトルは、交配したメスで見つかった3D20EのMSスペクトルと一致しました（図4c）。

図の凡例には、実行された統計テストの具体的な詳細が含まれています。 GraphPad (バージョン 9.0) を使用して、フィッシャーの直接確率検定、マンテル-コックス検定、およびスチューデントの t 検定を実行しました。 Cochran-Mantel-Haenszel テストは、カスタマイズされた R スクリプト (https://github.com/duopeng/mantelhaen.test で入手可能) を使用して実行されました。 データ分布の正規性は、有意性しきい値 0.05 を使用した Shapiro-Wilk 検定で検定されました。 データが正規性テストに合格しなかった場合、マン・ホイットニー検定が実行されました。 生存データはマンテル-コックス検定で分析されました。 DESeq2 パッケージ (バージョン 1.28.1) を使用して、RNA-seq 遺伝子レベルの差次的発現解析を実行しました。 グラフの横棒は中央値を表します。 すべてのテストで、有意値 P = 0.05 を閾値として使用しました。

研究デザインの詳細については、この論文にリンクされている Nature Research Reporting Summary を参照してください。

すべてのオリジナルのウェスタンブロットは補足情報に記載されています。

MS プロテオーム データは、データセット識別子 PXD032157 とともに PRIDE パートナー リポジトリ (https://www.ebi.ac.uk/pride/) を通じて ProteomeXchange Consortium (http://proteomecentral.proteomexchange.org) に寄託されました。

RNA-seq データセットは、シリーズ レコード GSE198665 として Gene Expression Omnibus リポジトリ (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) に寄託されました。

現在の研究中に生成された、および/または現在の研究中に分析されたその他のデータセットは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。 ソースデータはこのペーパーに付属しています。

De Loof, A. エクジステロイド：見落とされている昆虫の性ステロイド？ 男性：ブラックボックス。 昆虫科学。 13、325–338 (2006)。

記事 Google Scholar

Redfern、CPF 20-ヒドロキシエクジソンとハマダラカハマダラカにおける卵巣の発達。 J.昆虫生理学。 28、97–109 (1982)。

記事 CAS Google Scholar

ガブリエリ、P. et al. ステロイドホルモン 20E の性的伝達はハマダラカハマダラカの交配後スイッチを誘発します。 手順国立アカデミー。 科学。 USA 111、16353–16358 (2014)。

記事 ADS CAS Google Scholar

世界保健機関。 世界マラリア報告書 2021 (世界保健機関、2021)。

チャールウッド、JD「マラリア媒介生物の生態」（CRC Press、2019）。

Zitnan, D. & Adams, ME 昆虫脱皮の神経内分泌調節。 in Insect Endocrinology (Gilbert, LI編) 106–176 (Elsevier、2012)。

ミッチェル、SN et al. ハマダラカの媒介能力に影響を与える性的形質の進化。 サイエンス 347、985–988 (2015)。

記事 ADS CAS Google Scholar

Hagedon, H. 生殖におけるエクジステロイドの役割。 総合分子昆虫科学 (ギルバート、LI 他編) 205–261 (Pergamon Press、2005)。

Williams-Ashman、HG & Reddi、AH 脊椎動物の性ホルモンの作用。 アンヌ。 Rev. Physiol. 33、31–82 (1971)。

記事 CAS Google Scholar

Pondevill, E.、Maria, A.、Jacques, J.-C.、Bourgouin, C. & Dauphin-Villemant, C. ハマダラカガンビエの雄は、交尾中に卵黄形成ステロイドホルモン 20-ヒドロキシエクジソンを産生し、雌に伝達します。 手順国立アカデミー。 科学。 USA 105、19631–19636 (2008)。

記事 ADS CAS Google Scholar

Baldini, F. et al. 性的に伝達されたステロイドホルモンと女性タンパク質の間の相互作用は、マラリア蚊ハマダラカハマダラカの卵形成を調節します。 PLoSバイオル。 11、e1001695 (2013)。

記事 CAS Google Scholar

Lafont, R.、Dauphin-Villemant, C.、Warren、JT & Rees、HH エクジステロイドの化学と生化学。 in Insect Endocrinology (Gilbert, LI編) 106–176 (Elsevier、2012)。

マルセナック、P. et al. 交配によって誘導される生殖遺伝子は、熱帯熱マラリア原虫感染に対するハマダラカの耐性を促進します。 PLoS 病巣。 16、e1008908 (2020)。

記事 CAS Google Scholar

ロイ、S.ら。 蚊の繁殖における遺伝子発現パターンの制御。 PLoS ジュネット。 11、e1005450 (2015)。

記事 Google Scholar

Kapitskaya, MZ、Li, C.、Miura, K.、Segraves, W. & Raikhel, AS 核内受容体 HR3 をコードする初期-後期遺伝子の発現は、成虫の蚊におけるエクジソンに対する卵黄形成反応の調節への関与を示唆しています。 モル。 細胞。 内分泌。 160、25–37 (2000)。

記事 CAS Google Scholar

ダンナ、AN 他マラリア蚊ハマダラカハマダラカにおける吸血に関連する遺伝子発現パターン。 BMC ゲノミクス 6、5 (2005)。

記事 Google Scholar

ショー、WR 他交配により精子貯蔵器官のヘムペルオキシダーゼ HPX15 が活性化され、ガンビエハマダラカの繁殖力が確保されます。 手順国立アカデミー。 科学。 USA 111、5854–5859 (2014)。

記事 ADS CAS Google Scholar

De Loof、A. et al. 成虫の性分化：現在の（神経）内分泌の概念を再評価するためのモデルとしての、Schistocerca gregaria の雄特有の表皮の黄変。 J.昆虫生理学。 56、919–925 (2010)。

記事 Google Scholar

チェン、PS 他。 雌のキイロショウジョウバエの生殖行動を制御する雄の副腺ペプチド。 セル 54、291–298 (1988)。

記事 CAS Google Scholar

アビラ、FW 他昆虫の精液タンパク質: 同定と機能。 アンヌ。 Entomol 牧師。 56、21–40 (2011)。

記事 CAS Google Scholar

Yapici, N.、Kim, YJ、Ribeiro, C. & Dickson, BJ ショウジョウバエの生殖行動における交配後のスイッチを媒介する受容体。 Nature 451、33–37 (2008)。

記事 Google Scholar

Häsemeyer, M.、Yapici, N.、Heberlein, U. & Dickson, BJ ショウジョウバエの生殖管の感覚ニューロンは雌の生殖行動を調節します。 ニューロン 61、511–518 (2009)。

記事 Google Scholar

ベネディクト、MQ 不妊昆虫技術: 過去からの教訓。 J.Med. 昆虫。 58、1974 ～ 1979 年 (2021)。

記事 Google Scholar

Werling, K. et al. ステロイドホルモンの機能は、ハマダラカにおける非競合的なマラリア原虫の発生を制御します。 セル 177、315–325 (2019)。

記事 CAS Google Scholar

Magnusson、K. et al. マラリア媒介ハマダラカハマダラカにおける個体発生時の性偏り遺伝子の転写制御。 PLoS ONE 6、e21572 (2011)。

記事 ADS CAS Google Scholar

イェ、J.ら。 Primer-BLAST: ポリメラーゼ連鎖反応用のターゲット特異的プライマーを設計するツール。 BMC バイオインフォマティクス 13、134 (2012)。

記事 CAS Google Scholar

マリノッティ、O.ら。 ガンビアハマダラカ成体における遺伝子発現のゲノムワイドな解析。 昆虫モル。 バイオル。 15、1–12 (2006)。

記事 CAS Google Scholar

Findlay, GD、Yi, X.、MacCoss, MJ & Swanson, WJ プロテオミクスは、交配時に転移した新規ショウジョウバエ精液タンパク質を明らかにしました。 PLoSバイオル。 6、1417–1426 (2008)。

記事 CAS Google Scholar

Sirot、LK et al. デング熱媒介蚊の精液プロテオームに向けて: タンパク質の同定と潜在的な機能。 PLoSネグル。 トロップ。 ディス。 5、e989 (2011)。

記事 CAS Google Scholar

Gouw, JW, Tops, BBJ & Krijgsveld, J. 重窒素 (15N) を使用したモデル生物の代謝標識。 方法 Ｍｏｌ． バイオル。 753、29–42 (2011)。

記事 CAS Google Scholar

Eng、JK、Jahan、TA、Hoopmann、MR Comet: オープンソースの MS/MS シーケンス データベース検索ツール。 プロテオミクス 13、22–24 (2013)。

記事 CAS Google Scholar

Käll, L.、Canterbury, JD、Weston, J.、Noble, WS & MacCoss, MJ ショットガン プロテオミクス データセットからのペプチド同定のための半教師あり学習。 ナット。 方法 4、923–925 (2007)。

記事 Google Scholar

リフル、M.ら。 質量分析法を使用した、特性が解明されていない薬物とタンパク質の付加物の発見と視覚化。 アナル。 化学。 94、3501–3509 (2022)。

記事 CAS Google Scholar

Marchler-Bauer、A. et al. CDD: NCBI の保存ドメイン データベース。 核酸研究所 43、222–226 (2015)。

記事 Google Scholar

ブランディン、S.ら。 補体様タンパク質 TEP1 は、マラリア媒介ハマダラカハマダラカの媒介能力の決定因子です。 セル 116、661–670 (2004)。

記事 CAS Google Scholar

Bascuñán, P.、Gabrieli, P.、Mameli, E.、Catteruccia, F. 交配によって調節される心房プロテアーゼはハマダラカ ガンビエ雌の再受精率を制御します。 科学。 議員第 10 号、21974 (2020)。

記事 ADS Google Scholar

Dinan, L. & Rees, HH 3-エピ-エクジソンおよび 3-エピ-20-ヒドロキシエクジソンの調製。 ステロイド 32、629–638 (1978)。

記事 CAS Google Scholar

リファレンスをダウンロードする

蚊の飼育に協力してくれた E. Nelson、K. Thornburg、E. Selland、および原稿に関するコメントをくれた Catteruccia 研究室のメンバーに感謝します。 この研究の資金は、ハワード・ヒューズ医学研究所とビル・アンド・メリンダ・ゲイツ財団（BMGF）共同の教員奨学生賞（助成金ID OPP1158190）および国立衛生研究所（NIH）（賞番号R01 AI104956およびR01 AI124165）によって提供されました。 FC プロテオミクス研究は NIH (P41 GM103533) から MJM への支援を受けました RNA-seq 研究はハーバード データ サイエンス イニシアチブ (博士研究員研究基金、2019) から DP へ支援されました この出版物の発見と結論は著者のものであり、そうではありません必然的に、HHMI、BMGF、または NIH の立場または政策が反映されます。 FC は HHMI の調査員です。

エヴドクシア・G・カカニ＆サラ・N・ミッチェル

現在の住所: Verily Life Sciences、米国カリフォルニア州サウスサンフランシスコ

エンツォ・マメリ

現在の住所: 米国マサチューセッツ州ボストン、ハーバード大学医学部ブラバトニク研究所遺伝学科

米国マサチューセッツ州ボストン、ハーバード大学THチャン公衆衛生大学院免疫感染症学科

デュオ・ペン, エヴドクシア・G. カカニ, エンツォ・マメリ, サラ・N. ミッチェル, ケルシー・アダムス, タスニーム・A. リンヴィー, W. ロバート・ショー & フラミニア・カテルッチャ

ハーバード質量分析センター、ケンブリッジ、マサチューセッツ州、米国

チャールズ・ビドゥーデス

ワシントン大学ゲノム科学部、シアトル、ワシントン州、米国

ジェニファー・E・メリヒュー & マイケル・J・マッコス

ハワード・ヒューズ医学研究所、チェビー・チェイス、メリーランド州、米国

フラミニア・カテルッチャ

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

DP、EGK、SNM、WRS、FC がこの研究を考案し、実験を計画し、データを解釈しました。 DP、EGK、SNM、KA、および TAR は交配アッセイを実施しました。 CV はエクジステロイド質量分析を実施しました。 EGK と SNM は RNA-seq サンプルの収集とライブラリーの調製を実行しました。 DP、EGK、SNM は RNA-seq データを分析しました。 DP は、カスタマイズされたバイオインフォマティクス パイプラインを構築しました。 EM は、生物全体の同位体標識とプロテオームサンプルの収集を実行しました。 GEM と MJM はプロテオーム質量分析を実施しました。 DP はウェスタンブロットを実行し、カスタマイズされた抗体の生産を調整しました。 DP、EGK、SNMおよびTARは、dsRNAサイレンシング、遺伝子発現RT-qPCR分析、産卵アッセイおよび再交配アッセイを実施しました。 DP と TAR は死亡率アッセイを実施しました。 DP は化学合成を実行し、組換えタンパク質を発現および精製し、酵素アッセイを実行しました。 DP、WRS、FC がこの論文を執筆しました。 FCが研究を監督した。

フラミニア・カテルッチャへの対応。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature は、この研究の査読に貢献してくれた Michael O'Connor と他の匿名の査読者に感謝します。 査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

3D20E および 3D20E22P は、(a) 処女血を与えられた雌および (b、左) 新たに羽化した (羽化後 1 日以内) 雌では検出されませんが、(b、右) 新しく羽化した雌の副腺 (MAG) では特異的に検出されます。 - 巣から出た雄。 E、20E、および 20E22P は、ほとんどのサンプルでさまざまなレベルで検出されます。 すべてのパネルで: データは 3 つの生物学的複製から得られた平均値 ± sem として表示されます (pbm = 血液粉砕後)

ソースデータ

(a) 交尾した女性の心房内で性的に移入された EPP によって触媒されると予想される反応の概略図。 点線は、EPP の標的となるリン酸部分を強調しています。 組換え EPP (rEPP) は、in vitro で 3D20E22P の脱リン酸化を触媒します。 3D20E22P (HPLC-MS/MS によって MAG から抽出) を基質として使用し、HPLC-MS/MS を使用して、組換え酵素とのインキュベーション後の 3D20E 生成を検出しました。 DHFR: ジヒドロ葉酸レダクターゼ、ネガティブコントロールとして使用。 HI: 熱不活化 rEPP、2 番目のネガティブ コントロールとして使用します。 データは、3 回の in vitro アッセイ反復から得られた平均値 ± 標準誤差として表示されます。 （ b ）0日目のdsGFPと比較したMAGにおけるEPP発現（赤）およびホスファターゼ活性（紫）の経時的分析（平均±sem）。 EPP レベルは注射後 2 日 (dpi) で最低になり、ホスファターゼ活性は 3 ～ 4 dpi で最低になりました。 データは 3 つの複製からプールされました。 （ c ）dsRNA注射のRT-qPCRサイレンシング効率。ハウスキーピングリボソーム遺伝子RpL19に対して正規化され、GFPコントロールと比較した標的遺伝子の発現として計算されます（平均±sem）。 データは 3 つの複製からプールされました。

ソースデータ

3D20E 注射 (0.63 μg) は、同量の 20E と比較して、著しく強力な MISO 発現を誘導します。 3D20E 注射はまた、EcR アイソフォーム A (EcR-A)、および交配誘導遺伝子 AGAP006421、AGAP004263、および HPX15 の発現を特異的またはより強力に活性化しますが、これらは EcR アイソフォーム EcR-B を抑制します。 20E 注射は、卵黄タンパク質遺伝子 Vg および HR4 を特異的に活性化し、HR3 発現をより強力に誘導します（データは、それぞれ 10 匹の蚊のプールの 3 つの生物学的複製から得られた平均値 ± sem として示されています（HR4 データは、蚊のプールの 4 つの生物学的複製から得られました）それぞれ 10 匹の蚊）、対応のない両側 FDR 補正 t 検定を 20E と 3D20E の比較のために実施しました；各棒の上の統計的有意性は 10% EtOH 注入との比較を示します：対応のない t 検定、両側）。 P 値については補足表 3 を参照してください。

ソースデータ

(a) 雄の生存は、EcK1 および EcK2 のサイレンシングによって悪影響を受けますが、EPP には影響を受けません。 生存率は、dsGFP 対照と比較して、EcK1 サイレンシング雄 (左) および Eck2 サイレンシング雄 (中央) では大幅に低下しますが、EPP サイレンシング雄 (右) では低下しません (平均 ± sem、n は生物学的に独立した蚊サンプルの数を示します) 、マンテル-コックス検定、両側)。 (b–c) HPLC-MS/MS で測定したところ、組換え EcK2 (rEcK2) は (b) 20E を効率的にリン酸化しますが、(c) 3D20E はリン酸化しません。 平均±標準誤差は、3 回の in vitro アッセイ反復から得られました。 ネガティブコントロール (DHFR および熱不活化、HI、rEcK2) は 20E または 3D20E をリン酸化しません。 EcK2 によって触媒される反応の概略図が提供されます。

ソースデータ

(a) EcK2 の発現は処女雌の下部生殖管 (LRT) で高く、交配後に抑制されます。 採血は、採血後のさまざまな時点で EcK2 発現に影響を与えません (pbm) (0 時間: P = 0.024、3 時間: P = 0.031、24 時間: P = 0.029、平均値 ± sem、対応のない t 検定、one-側面）。 (b) 20E22P は、採血後の処女雌の LRT で検出されます (平均値±標準誤差)。 定量化は、HPLC-MS/MSを使用して実行されました。 点線は、異なる時点における同じエクジステロイドの平均値を結んでいます。 （ c ）給血前のEcK2サイレンシングは、処女雌のLRTにおける26 pbmでの20E対20E22Pの比を有意に増加させます（ P = 0.047、平均±sem、対応のないt検定、片側）。 （ d ）血液を与えられた処女雌における交尾受容性（交尾プラグの存在によって評価される）は、EcK2サイレンシングの影響を受けない（P = 0.50、フィッシャーの直接確率検定、両側、2つの反復からプールされたデータ）。 （ e ）交尾受容性は、EcK2サイレンシングによって処女では影響を受けません（ P = 0.98、コクラン・マンテル・ヘンツェル検定、両側）。 （f）採血前にEcK2がサイレンシングされている場合（上）、処女の産卵は高度に誘発されます（P = 3.30e-06、コクラン・マンテル・ヘンツェル検定、両面、データは4回の反復からのもの）が、この場合はそうではありません。キナーゼは吸血後に沈黙する（下）（P = 0.94、コクラン・マンテル・ヘンツェル検定、両側）。 (g) EcK2 発現は、10% EtOH を注入した対照と比較して、20E または 3D20E の注入によって抑制されません。 発現値は、倍率変化を計算する前に、それぞれのサンプルのハウスキーピング遺伝子 RpL19 に対して正規化しました (平均 ± sem、対応のない t 検定、両側、20E: P = 0.46、3D20E: P = 0.85)。 すべてのパネルにおいて: n は生物学的に独立した蚊サンプルの数を示します。ns = 有意ではありません。 * P < 0.05、** P < 0.01、*** P < 0.001、**** P < 0.001。特に断りのない限り、データはすべてのパネルの 3 つの生物学的複製からのものです。

ソースデータ

図 2d の生成に使用されるトリミングされていない画像。

交尾中に雄から雌の心房に転送されるタンパク質のリスト（エジャクロム）。 詳細については、図 2c と方法を参照してください。 タンパク質の存在量は、3 つの時点にわたる 2 つの反復にわたる NSAF として示されます。

MS によって MAG で検出されたタンパク質のリスト。 タンパク質の存在量は、3 回の反復にわたる NSAF として示されます。

dsRNA 構築物の配列 (標的遺伝子特異的配列)。

オープン アクセス この記事はクリエイティブ コモンズ表示 4.0 国際ライセンスに基づいてライセンスされており、元の著者と情報源に適切なクレジットを表示する限り、あらゆる媒体または形式での使用、共有、翻案、配布、複製が許可されます。クリエイティブ コモンズ ライセンスへのリンクを提供し、変更が加えられたかどうかを示します。 この記事内の画像またはその他のサードパーティ素材は、素材のクレジットラインに別段の記載がない限り、記事のクリエイティブ コモンズ ライセンスに含まれています。 素材が記事のクリエイティブ コモンズ ライセンスに含まれておらず、意図した使用が法的規制で許可されていない場合、または許可されている使用を超えている場合は、著作権所有者から直接許可を得る必要があります。 このライセンスのコピーを表示するには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ にアクセスしてください。

転載と許可

Peng, D.、Kakani, EG、Mameli, E. 他男性のステロイドは、マラリア蚊の女性の性行動を制御します。 Nature 608、93–97 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41586-022-04908-6

引用をダウンロード

受信日: 2022 年 1 月 24 日

受理日: 2022 年 5 月 25 日

公開日: 2022 年 7 月 6 日

発行日: 2022 年 8 月 4 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-022-04908-6

次のリンクを共有すると、誰でもこのコンテンツを読むことができます。

申し訳ございませんが、現在この記事の共有リンクは利用できません。

Springer Nature SharedIt コンテンツ共有イニシアチブによって提供

BMC ゲノミクス (2022)

コメントを送信すると、利用規約とコミュニティ ガイドラインに従うことに同意したことになります。 虐待的なもの、または当社の規約やガイドラインに準拠していないものを見つけた場合は、不適切としてフラグを立ててください。