エストロゲン欠乏によって引き起こされる耳の変化に対するホルモン療法の効果

Scientific Reports volume 12、記事番号: 22596 (2022) この記事を引用

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良性発作性頭位めまい症（BPPV）は、閉経期および/または骨減少症に関連しています。 卵巣摘出術（OVX）後の耳円層の形態学的変化が報告されています。 さらに、ホルモン補充療法は BPPV リスクを減少させます。 しかし、エストロゲン欠乏によって引き起こされる耳の変化に対するホルモン療法の効果に関する知識は限られています。 私たちは、エストロゲン欠乏によって引き起こされる耳の変化に対するホルモン療法の効果を調べることを目的としました。 私たちは、ホルモン療法が OVX によって引き起こされる耳の変化を軽減できるのではないかという仮説を立てました。 8 週齢の C57BL/6 マウスを 4 つのグループに分けました: ビヒクルの移植を伴う偽手術 (sham + v)、ビヒクルの移植を伴う OVX (OVX + v)、エストラジオールの移植を伴う OVX (E2) (OVX + E2) ）、およびラロキシフェン（RAL）の移植を伴う OVX（OVX + RAL）グループ。 OVX または偽手術の 4 週間後に、マイクロ CT によって耳蓋層の体積を測定しました。 耳水疱は除去されました。 エストロゲン受容体αおよび4-ヒドロキシノネナールについて免疫組織化学を実施した。 耳円錐層の体積は、偽 + v グループよりも OVX + v の方が有意に高かった。 E2 と RAL は、子宮内膜層のこれらの変化を大幅に減少させました。 エストロゲン受容体アルファおよび 4-ヒドロキシノネナールの染色は、偽 + v グループよりも OVX + v の方が強かったが、偽 + v、OVX + E2、および OVX + RAL グループでは同等でした。 これらの結果は、E2およびRALが、酸化ストレスの減少を介して、エストロゲン欠乏によって引き起こされる耳円層の形態変化に対して効果的であることを示しています。

良性発作性頭位めまい症 (BPPV) は一般的な前庭疾患です。 典型的な BPPV 発作は、頭部の水平または垂直の動きによって引き起こされます。 何人かの患者は、ベッドで横になっているとき、寝返りをしているとき、または起き上がっているときに重度のめまいの発作が起こると主張しています。 生涯にわたる BPPV の累積発生率は、80 歳の時点でほぼ 10% です1。 BPPV の病因として広く受け入れられているのは、卵形嚢から取り除かれた耳円盤破片が内リンパに流れ込み、三半規管に閉じ込められることです。 頭の位置が変化すると、重力によって耳円盤の破片が移動し、異常な内リンパ流に追従して不適切なカピュラ信号が発生し、最終的にめまい発作を引き起こします。 管再配置療法を行わない BPPV の自然経過では、数週間の自然寛解が生じます 2。 小鼻の位置を変える手術は、BPPV 患者に対してよく行われます。 小鼻再配置処置の治癒率は、無治療の場合 (36.4%) と比較して高く (94.2%)、6 か月以内の再発率は 3.8% であると報告されています3。 短期的な影響にもかかわらず、BPPV 患者の 33.8 ～ 50% が数年以内に再発することが報告されており 4、5、6、7、BPPV は患者の生活の質を損なう 8。 ただし、BPPV に対する標準治療はありません。

以前の研究によると、BPPV は中年の女性に最も一般的であり 9、ホルモン補充療法によりそのリスクが軽減されます 10。 さらに、BPPV患者は骨密度が低く、血清ビタミンD濃度が低い傾向がある6、11、12、13、14、15、16、再発患者はビタミンDレベルが低いことが報告されています。非再発群よりも高い6、12、15、17。 これらの研究は、BPPV が閉経後の状態または骨代謝障害に関連していることを示唆しています。 以前の動物研究では、エストロゲン欠乏症と骨粗鬆症を誘発する両側卵巣切除術（OVX）により、耳の形態学的変化が引き起こされました18、19、20。 植物エストロゲンの補給により、OVX18 によって誘発される耳の変化が防止されることも報告されています。 エストロゲンには抗酸化特性があることが示されています 21 が、他の研究では BPPV が酸化ストレスと関連していることが報告されています 22、23、24。 しかし、エストロゲン欠乏による耳の変化に対するエストロゲンまたは骨粗鬆症治療薬の影響や、エストロゲン欠乏と卵形嚢の酸化ストレスとの関係を調査した研究はありません。 したがって、本研究ではこの問題を検討することを目的としました。

エストロゲンはステロイドホルモンであり、核内受容体の 1 つであるエストロゲン受容体 (ER) を介して転写因子として作用します25。 エストロゲンの投与は更年期症状に適用されます26。 しかし、閉経後骨粗鬆症の治療のためのエストロゲンの投与には議論の余地がある27、28、29。 このような治療には、ラロキシフェン（RAL）の投与が広く行われています。 RAL は選択的 ER モジュレーター (SERM) です。 さらに、これは ER27 に結合する非ステロイド性薬剤です。 アゴニストまたはアンタゴニストとしてのその作用は、器官組織に応じて異なります30。 しかし、RAL が内耳においてアゴニストとして作用するかアンタゴニストとして作用するかは不明のままです。 この問題を検討するために、この研究では骨粗鬆症の治療に RAL を選択しました。 私たちの仮説は、エストロゲンまたは骨粗鬆症の治療薬は、酸化ストレスを軽減することにより、エストロゲン欠乏によって引き起こされる耳の変化を防ぐことができるというものでした。 この研究は、BPPV の発生を予防するための治療選択肢に関する有用な情報を提供する可能性があります。

図 1 は、術後 4 週間の各グループの子宮重量測定値を示しています。 子宮重量は、シャム + ビヒクル (シャム + v)、OVX + ビヒクル (OVX + v)、OVX + エストラジオール (OVX) で、86.4 ± 39.4 mg、12.0 ± 3.0 mg、217.7 ± 30.1 mg、および 25.8 ± 4.4 mg でした。 + E2)、および OVX + ラロキシフェン (OVX + RAL) グループ。 OVX + v グループの子宮重量は、偽 + v グループよりも有意に低かった (p < 0.001)。 OVX + E2 グループの子宮重量は、OVX + v (p < 0.001) および OVX + RAL グループ (p < 0.001) よりも有意に高かった。 これらのデータは、OVX が正しく行われ、エストラジオールのペレットがマウスに吸収され、ラロキシフェンのペレットが子宮に強い影響を及ぼさないことを示しました。

子宮の重量 (各 n = 9 ～ 15)。 卵巣摘出術（OVX）後、子宮の重量が減少しました。 エストラジオール (E2) の投与は、ビヒクルを使用した OVX と比較して子宮の重量を有意に増加させました (p < 0.001)。 子宮重量は、OVX + v グループよりも OVX + ラロキシフェン (RAL) の方が有意に高かった (p = 0.002)。 (ANOVA: p < 0.001、*: p < 0.01)。

図 2 は、術後 4 週間における各グループの大腿骨の総骨塩密度 (BMD) を示しています。 大腿骨の BMD は、シャム + v、OVX + v、OVX + E2、および OVX + RAL で 28.8 ± 1.0 mg/cm3、27.3 ± 0.7 mg/cm3、36.7 ± 1.0 mg/cm3、および 31.2 ± 1.2 mg/cm3 でした。それぞれのグループ。 BMD は、偽 + v グループよりも OVX + v の方が有意に低かった (p < 0.001)。 BMD は、OVX + E2 および OVX + RAL グループの方が、OVX + v グループよりも有意に高かった (両方とも p < 0.001)。 これらのデータは、エストラジオールとラロキシフェンの投与が骨代謝に効果的であることを実証しました。

DEXA によって測定された大腿骨の骨密度 (BMD) (各 n = 9 ～ 25)。 大腿骨の BMD は、偽 + v グループよりも OVX + v の方が有意に低かった (p < 0.001)。 エストラジオールまたはラロキシフェンの投与により、OVX + v グループと比較して大腿骨の BMD が有意に増加しました (それぞれ p < 0.001 および p < 0.001)。 (ANOVA: p < 0.001、*: p < 0.01)。

図 3 は、術後 4 週間の各グループのマイクロ CT (μCT) によって得られた卵形嚢耳円盤層の体積を示しています。 卵形嚢耳円盤層の体積は、偽の場合、481,272.0 ± 19,998.2 µm2、511,274.3 ± 20,755.1 µm2、472,776.9 ± 29,765.6 µm2、および 483,702.3 ± 21,973.8 µm2 でした。それぞれ + v、OVX + v、OVX + E2、および OVX + RAL グループ。 卵形嚢耳円盤層の体積は、偽 + v 群よりも OVX + v 群の方が有意に高かったが (p < 0.001)、偽 + v、OVX + E2、および OVX + RAL 群では有意な差はありませんでした。 。

卵形嚢耳円盤層の体積は、マイクロ CT スキャンを使用して測定されました（各 n = 10 ～ 26）。 OVX + v グループの卵形嚢耳円盤層の体積は、sham + v グループよりも有意に高かった (p < 0.001)。 OVX + E2 および OVX + RAL グループの卵形嚢耳円盤層の体積は、OVX + v グループよりも有意に低かった (それぞれ p = 0.007 および p = 0.04) (ANOVA: p < 0.001、*: p < 0.01、**: p < 0.05)。

卵形嚢における総mRNAの示差的発現解析を実施した。 耳円層の体積の結果を得た後、OVX + v グループのデータを偽 + v、OVX + E2、OVX + RAL グループのデータと比較しました。 OVX + E2 群と OVX + v 群を比較すると、OVX + E2 群では Gstp2 の発現が有意に高く、OVX では Orc8、Amd2、Mettl16、Slc35b1、Cog5、Wdr41、Sra1、Stard8 の発現が有意に高かった。 + E2 グループは有意に低かった。 OVX+RAL群とOVX+v群、sham+v群とOVX+v群とを比較すると、Gstp2遺伝子の発現はOVX+RAL群とsham+v群で有意に高いことがわかった。 前述したように、Gstp2 遺伝子の発現は、OVX + v 群では他の群に比べて有意に低かった（図 4 および 5）。 Gstp2 はグルタチオン S-トランスフェラーゼ (GST) pi2 をコードします。 GST pi2 (GSTP) は、活性酸素種または内因性および外因性の有毒化合物を解毒できる第 II 相解毒酵素です 31。

マウスの卵形嚢における mRNA 発現のベン図。 偽発見率 0.05 (各 n = 5) での、OVX + ビヒクル グループと比較した、偽 + ビヒクル、OVX + エストラジオール、および OVX + RAL グループの卵形嚢における mRNA 発現の差異のベン図。 OVX + ビヒクル群では、他の群と比較して Gstp2 の発現のみが有意に減少しました。

卵形嚢における Gstp2 の発現 (各 n = 5)。 OVX + ビヒクルグループにおける Gstp2 の発現は、他のグループよりも有意に低かった (偽発見率 [FDR]-p < 0.001 vs. 偽 + ビヒクルグループ; FDR-p = 0.02 vs. OVX + エストラジオールグループ; FDR- p = 0.003 対 OVX + ラロキシフェン グループ)。

OVX + v グループでは、偽 + v グループよりも卵形嚢での ER アルファ (ERα) の強度が高く観察されました。エストラジオールまたはラロキシフェンによる治療により、偽 + v グループで観察されたレベルまで低下しました (図 2)。 6)。 さらに、4-ヒドロキシノネナール (4-HNE) の強度は、OVX + V グループで他のグループよりも著しく高かった。 特に 4-HNE は脂質過酸化の代謝産物であり、酸化ストレスマーカーであることが知られています 32。

卵形嚢の免疫組織化学。 エストロゲン受容体アルファ (ERα) と 4-ヒドロキシノネナール (4-HNE) の両方の染色は、偽 + ビヒクル群よりも OVX + ビヒクル群の方が著しく強かった。 OVX + エストラジオール群および OVX + ラロキシフェン群における ERα および 4-HNE の染色は、OVX + ビヒクル群よりも低く、偽 + ビヒクル群の染色と同等でした。

この研究では、卵形嚢耳円盤層の体積が OVX によって大幅に増加し、エストロゲン欠乏症が引き起こされたことがわかりました。 E2 または RAL の投与は、OVX によって引き起こされる耳円盤層のこれらの形態学的変化を防止しました。 RNA-seq 解析により、GSTP をコードする Gstp2 の発現が OVX + v グループで有意に減少していることが明らかになりました。 免疫組織化学的分析により、ERαおよび4-HNEの発現がOVX + vグループで他のグループよりも高いことが示されました。 これらの結果は、E2 または RAL の投与が、ER を介した酸化ストレスを抑制することにより、エストロゲン欠乏によって引き起こされる卵形嚢耳円盤層の形態的変化を軽減するのに効果的であることを示唆しています。

以前の研究では、OVX が大きくて弛んだ耳嚢 19 と、卵形嚢内の耳嚢層の容積を増加させる 20 とを報告しました。 OVX + v グループの調査結果は、前述のレポートの調査結果を裏付けています。 E2 と RAL が OVX による耳形成層のこれらの変化を抑制することは注目に値します。 私たちのデータはERα発現の変化を示しましたが、ERβは内耳で安定している一方でエストロゲンがERαの発現を調節することが以前の研究で示されていたため、ERβは測定しませんでした33。 しかし、ERαとERβが卵形嚢の構造を維持するためにどのように機能するかは依然として不明です。 エストロゲン欠乏とERαまたはERβとの関連を調査するには、さらなる研究が必要です。

RNA-seq分析により、Gstp2の発現がOVX + vグループで他のグループよりも有意に低いことが明らかになりました（図4および5）。 Gstp2 GSTP、GST ファミリのメンバー。 GST は、内因性または外因性の生体異物を解毒して細胞を保護する第 II 相酵素です 31。 GST は求電子試薬の結合を触媒し、グルタチオンによる細胞機能不全を引き起こします。 生成されたグルタチオン結合体は、細胞を損傷から保護する多剤耐性タンパク質であるトランスポーターを介して細胞外に排出されます 34,35。 この解毒作用に加えて、GSTP はストレスキナーゼシグナル伝達経路を調節することが最近報告されています 36、37、38。 Jun-terminal kinase (JNK) は、酸化ストレス、頭部ショック、炎症性サイトカインなどのストレスによって引き起こされる代表的なストレスキナーゼです 39,40,41。 GSTP は、基本的な JNK 活性を維持しながら、JNK と複合体を形成します。 酸化ストレス、サイトカイン、または薬物は、GSTP-JUN 複合体の分解と JNK シグナル伝達の活性化を引き起こし、アポトーシスまたは増殖を引き起こします 36,39,42。 ムツサミら。 OVX は GST43 を含む抗酸化システムの障害を誘発することを報告しました。 我々の結果は、エストロゲン欠乏によりGSTP発現が減少し、酸化成分の細胞内蓄積につながることを示唆しています。

卵形嚢における 4-HNE および ERα の染色強度は、他のグループよりも OVX + v で強かった (図 5)。 OVX + v グループにおける ERα の強い強度は、エストロゲン欠乏のフィードバックを表している可能性があります。 特に 4-HNE は脂質過酸化の代謝産物であり、酸化ストレスマーカーとしてよく知られています 32。 以前の研究では、閉経が酸化ストレスの増加を誘発し、抗酸化活性が低下することが実証されています43、44、45、46、47、48、49。 さらに、ホルモン補充療法 44、45、46、47 または抗酸化剤の補給 48 が OVX の副作用を防ぐことが報告されています。 エストロゲンには、ER21,50,51 とは独立した抗酸化特性があることも報告されています。 これらの研究により、エストロゲンと酸化ストレスとの間に強い関係があることが明らかになりました。 最近のいくつかの臨床研究では、BPPV が酸化ストレスと関連していることも示されています 22、23、24。 前述のことに基づいて、酸化ストレスの制御は、特に閉経周辺期患者にとって、BPPV に対する新しいアプローチである可能性があることが示唆されます。

今回の研究では、E2とRALが耳円層の形態変化の抑制に効果を示した。 SERM の 1 つである RAL は、乳腺や子宮の ER に対する不要な影響を防ぎます 30。 したがって、RAL は更年期骨粗鬆症の治療に頻繁に使用されます 27,52。 RAL は、骨内の ER にアゴニストとして作用し、乳腺または子宮内の ER にアンタゴニストとして作用します 49。 これにより、エストロゲン誘発腫瘍のリスクを抑制できます30。 SERM のこの独特な作用のメカニズムは、ER の発現の違い、リガンド結合における ER の構造の違い、標的細胞における補調節タンパク質の発現と結合の違いによって説明できる可能性があることが報告されています 53。 ER は内耳に広く存在することが示されています 54。 しかし、内耳の小胞体に対するその作用は不明です。 この研究では、E2と同様に、RALはOVXによって引き起こされる耳円盤層の形態学的変化を防止しました。 さらに、免疫組織化学の結果は、卵形嚢におけるOVX + E2の強度がOVX + RALの強度とほぼ同じであることを示しました。 ただし、RAL が内耳に直接作用するかどうかは不明です。 RALの投与による骨代謝の改善は、エストロゲン欠乏による耳円層の変化を間接的に緩和する可能性がある。 骨代謝は、骨細胞または骨芽細胞を介したグルコース代謝、リンパ球生成、および脂肪代謝に関連していることが報告されています55,56。 骨細胞または骨芽細胞によって分泌されるいくつかの因子も、耳石の代謝を調節する可能性があります。 SERMが内耳に直接的または間接的に影響を与えるかどうかを特定するには、さらなる研究が必要です。

この研究にはいくつかの制限があります。 まず、マウスは培養細胞のように遺伝的にモノクローナルではないため、RNA 分析中に偽陰性遺伝子が存在した可能性があります。 さらに、遺伝子発現の変化を検証するためのリアルタイム PCR アッセイは実行されませんでした。 第二に、酸化ストレスがどのようにオトコニアを形態学的に変化させるのかは依然として不明である。 オトコニアは主に構成タンパク質、アンカータンパク質、および調節タンパク質で構成されていることが示されています57。 酸化ストレスもこれらのタンパク質の発現に影響を与える可能性があります。 耳円錐構造または前庭環境に対する酸化ストレスの影響の根底にある分子機構を特定するには、さらなる研究が必要です。 第三に、μCTのみを使用して卵形嚢耳円盤層の体積を評価し、組織病理学や走査型電子顕微鏡（SEM）などの他の技術は実行しませんでした。 我々は以前、μCTを使用して測定した耳円層の体積が病理組織学的研究結果と有意に関連していることを報告しました20。 したがって、μCT の結果は信頼できると考えられました。 ただし、μCT のボクセルサイズは 6 μm であるため、詳細な観察には SEM が必要でした。 第四に、この研究では発情周期が考慮されていませんでした。 マウスの発情周期は 4 ～ 5 日です 58。 ただし、発情周期が前庭系に影響を与えるかどうかは報告されていません。 発情周期が耳の構造に影響を与えるかどうかを確認するには、今後の研究が必要です。 なお、血清E2測定はコストが高いため測定しませんでした。 代わりに、子宮重量とBMDを測定することによって間接的にE2欠乏症を確認します。 この研究では、子宮重量と BMD の両方が OVX によって大幅に減少したため、OVX マウスは E2 欠乏していると考えられました。 ただし、E2 測定を含めるためにはさらなる研究が必要です。 最後に、ペレットによって投与される E2 および RAL の用量は、臨床的に使用される用量よりも高かった 59,60。 この研究では、動物のストレスを防ぐためにペレットを使用して E2 または RAL を投与しました。 ただし、これらの薬剤の低用量が OVX による耳膜層の形態変化の予防に有効であるかどうかを調べるには、さらなる研究が必要です。

結論として、エストロゲン欠乏は卵形嚢の耳円盤層の形態変化を引き起こし、E2またはRALの投与は耳円盤層のこれらの変化を防止した。 E2 または RAL の効果の根底にあるメカニズムは不明のままです。 しかし、この研究の結果は、E2 と RAL が酸化ストレスを軽減することを示唆しています。 E2 または RAL が ER を介して酸化ストレスを軽減するかどうかを調査するには、さらなる研究が必要です。

研究計画は愛媛大学動物実験倫理委員会の承認を受けた（番号05HI77-1）。 すべての方法は、関連するガイドラインおよび規制に従って実行されました。 この研究は ARRIVE ガイドライン (https://arriveguidelines.org) に従って実施されました。

雌の C57BL/6 J マウスを日本 SLC (静岡県) から購入し、以下の 4 つのグループにランダムに分けました: (1) ビヒクル ペレットで偽手術 (偽 + v グループ)、(2) ビヒクル ペレットで OVX (OVX) + v グループ)、(3) 17β-エストラジオールを放出するペレットを含む OVX (OVX + E2 グループ)、および (4) SERM であるペレット放出ラロキシフェン (RAL) を含む OVX (OVX + RAL グループ)。 マウスは、8週齢で、メデトミジン（0.3 mg/kg）、ミダゾラム（4 ​​mg/kg）、およびブトルファノール（5 mg/kg）の腹腔内注射を使用して麻酔下で偽手術または卵巣切除のいずれかを行った。 OVX の手順では、腰の皮膚を切開し、腹膜を確認しました。 次に、腹膜を解剖し、卵巣を除去し、最後に切開部を縫合しました。 偽手術マウスでは、卵巣は同定されたが除去されず、OVXの直後にビヒクルペレットが皮下に移植された。 OVX マウスでは、以下のペレットを皮下に移植しました:ビヒクルペレット、徐放性エストラジオールペレット (50 μg/60 日)、または徐放性ラロキシフェンペレット (2.4 mg/60 日) (Innovative Research of America、フロリダ州サラソタ) 、米国）。 OVXまたは偽手術の後、さらなる試験までマウスをケージに戻した。 すべてのマウスは、温度 21 ～ 23 °C、明暗サイクル 12/12 時間（午前 7 時から午後 7 時まで点灯）の同じ環境で飼育され、標準的な餌を自由に摂取できました。愛媛大学の動物施設で水と水を自由に与えた。

OVX20 の 4 週間後に耳円盤層の体積が大幅に増加したという以前の研究の結果を考慮して、マウスは OVX または偽手術の 4 週間後に屠殺されました。 彼らはケタミン (200 mg/kg) とキシラジン (20 mg/kg) で深く麻酔され、安楽死させられました。 耳胞を除去し、4% パラホルムアルデヒド溶液で 24 時間固定し、0.1 M EDTA で 4 日間脱灰し、パラフィンに包埋しました。 大腿骨の総 BMD は、骨塩分析装置 (DCS-600EX、Aloka、東京、日本) を備えた二重エネルギー X 線吸光光度法を使用して測定されました。 OVX と薬物療法の効果を調べるために子宮重量を測定しました。

耳膜層の体積は、μCT (Scanco Medical、スイス、ブリュッティゼレン) を使用して評価されました。 我々は以前、μCTスキャン画像から得られた耳膜層の体積が組織学的研究で得られたものと相関していることを報告した20。 深い麻酔下でマウスを屠殺した後、耳水疱を除去し、4% パラホルムアルデヒド溶液で 24 時間固定しました。 耳嚢を 70% エタノールで 24 時間後固定し、等方性ボクセル サイズ 6 μm の Scanco Medical μCT35 システムを使用した μCT スキャンを実行しました。 スキャンは、70 kVp の X 線管電位および 114 μA の強度で実行され、卵形嚢耳円盤層の画像は ImageJ ソフトウェア (米国国立衛生研究所、ベセスダ、ミシガン州、米国) を使用して分析されました (図 7)。 ）。 二値化後、卵形嚢の耳の膜構造が決定されました。 4 つのグループのすべてのスライスからの卵形嚢膜構造の合計面積を比較しました。

卵形嚢のマイクロCT画像。 (a) 卵形嚢耳円盤層 (白い矢印) の元の画像は、マイクロ CT スキャンから得られました。 (b) Image J ソフトウェアを使用した耳円層の二値化画像。 二値化後、image J ソフトウェアを使用して卵形嚢耳円盤層の体積を計算しました。

断頭後、耳水疱を除去した。 楕円形の窓を水中で慎重に穿孔し、卵形嚢を解剖した。 卵形嚢は、RNAprotect Tissue Reagent (#76,104、Qiagen、ヒルデン、ドイツ) を使用して急速に安定化し、RNA 抽出まで 4 °C で保存しました。 メーカーの指示に従って、NucleoSpin RNA XS キット (#74,902.50、Macherey-Nagel、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国) を使用して、卵形嚢から全 RNA を抽出しました。 RNA の品質は、Agilent 2100 バイオアナライザー (#G2939A、Agilent Technologies、サンタクララ、カリフォルニア州、米国)、RNA6000 ピコキット (#5067–1513、Agilent Technologies)、および 2100 エキスパート ソフトウェア (バージョン B.02.07、Agilent) を使用してチェックされました。テクノロジー）。 7 を超える RNA 完全性数 (RIN) を示した高品質のトータル RNA をさらなる分析に使用しました (平均、7.96、7.30 ～ 8.24)。 RNA-Seq ライブラリーは、QuantSeq 3'mRNA-Seq Library Prep Kit for Illumina (FWD) (#015.384、LEXOGEN、ウィーン、オーストリア) を使用して、1 ng の全 RNA から構築しました。 構築されたライブラリーは、かずさ DNA 研究所 (千葉県) で NextSeq500 (Illumina) と NextSeq 5050/550 High Output Kit v2.5 (75 サイクル) (#20,024,906、Illumina) を使用して配列決定されました。 配列データは、CLC Genomics Workbench (Qiagen) を使用して分析されました。 簡単に言うと、fastq はライブラリ構築キットのガイドラインに基づいてトリミングされました。 特に、アダプターとポリA配列、および3'末端の低品質ヌクレオチドが除去されました。 5' 末端の最初の 12 ヌクレオチドのトリミングが実行され、20 ヌクレオチド未満の短い長さのリードがデータセットから削除されました。 トリミングされた fastq は、デフォルト設定を使用して Mus musculus (GRCm39.105) 参照配列にマッピングされました。 発現差解析はCPM正規化法により行った。

パラフィンに包埋した後、耳嚢の切片を採取します。 （4μm）を用意しました。 その後、それらを脱パラフィンし、再水和した。 抗原賦活化は、シトラコン酸緩衝液（Immunosaver®、#097-06,192、富士フイルム和光純薬株式会社）中で95℃のオートクレーブ内で45分間実行されました。 内因性ペルオキシダーゼ活性を 3% 過酸化水素で 15 分間阻害し、切片を RTU Animal Free Blocker and Diluent® (SP-5035、Vector Laboratories、バーリンゲーム、カリフォルニア州、米国) でブロックしました。 リン酸緩衝生理食塩水（PBS）ですすいだ後、切片をERα（1:200、#106,132-T08、Sino Biological）および4-HNE（1:400、#bs-6313R、Bioss）に対するウサギポリクローナル抗体とともに一晩インキュベートしました。 4℃で。 その後、再度 PBS ですすいだ後、二次抗体 (Histofine Simple Stain Mouse MAX-PO(R) #414,341、ニチレイ バイオサイエンス、東京、日本) とともに室温で 1 時間インキュベートし、DAB 色原体で 10 時間染色しました。分。 最後のすすぎの後、マイヤーヘマトキシリンを使用して対比染色を行った。

結果は平均値±標準偏差として表されます。 グループのデータは、ANOVA と Macintosh 用 JMP (SAS Institute Inc.、米国ノースカロライナ州ケアリー) による Steel-Dwass 検定を使用して比較されました。 統計的有意性は p < 0.05 に設定されました。 mRNA の差次的発現解析では、CLC Genomics Workbench (Qiagen) による t 検定を使用して、OVX + v グループのデータをシャム + v、OVX + E2、および OVX + RAL グループのデータと比較しました。 FDP p 値 < 0.05 は統計的に有意であるとみなされます。

現在の研究中に生成および/または分析されたデータセットは、GEO リポジトリ GSE216449 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE216449) で入手できます。

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マウスの世話をしていただいた愛媛大学先端研究支援センター（ADRES）動物施設スタッフの皆様に感謝いたします。

〒791-0295 愛媛県東温市志津川 愛媛大学大学院医学系研究科耳鼻咽喉科・頭頸部外科学

Takahiro Nakata, Masahiro Okada, Eriko Nishihara, Sawa Asoh, Taro Takagi & Naohito Hato

愛媛県立新居浜病院耳鼻咽喉科（新居浜市）

Takahiro Nakata

愛媛大学プロテオサイエンスセンター統合病態生理学分野

Aoi Ikedo & Yuuki Imai

愛媛大学先端研究支援センター医学研究支援部門

Naohito Tokunaga

愛媛大学大学院医学系研究科病態生理学教室

今井ゆうき

愛媛大学先端研究支援センター実験動物研究部門

今井ゆうき

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TN、MO、NH、YI がこの研究を発案し、原稿を執筆しました。 EN、SA、TT がデータ収集に関与しました。 AI、NT、YI がデータ収集、分析、解釈に関与しました。

Correspondence to Takahiro Nakata.

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

中田 哲也、岡田 正人、西原 栄 他エストロゲン欠乏によって引き起こされる耳の変化に対するホルモン療法の効果。 Sci Rep 12、22596 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-27240-5

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受信日: 2022 年 10 月 18 日

受理日: 2022 年 12 月 28 日

公開日: 2022 年 12 月 30 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-27240-5

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